小鼠生殖工程學(xué)技術(shù)——5凍存運(yùn)輸小鼠２細(xì)胞期胚胎
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◆材料
1. 2細(xì)胞期胚胎（新鮮或凍融復(fù)蘇后的胚胎）
2. 培養(yǎng)皿（coring 35mm X 10mm Cat.No.430588）
3. 電動(dòng)移液器（GILSON PIPETMAN P-200）
4. M２ Medium (Sigma Cat.No.M7167)
5. 0.5 mL EP管（Fisherbrand Flip Cap Microtubes 0.5 mL, Fisher Scientific Cat.No. FS-MCT-060-C）
6. 微管
7. KSOM/AA
8. 流動(dòng)石蠟（Nacalai Tesque Cat.No.26137-85）
9. 紐扣式溫度記錄儀（KN Laboratories temperature data logger Samokuron G type）
10. CARD 冷藏運(yùn)輸試劑盒
o 紙盒（free-s1 Cat.No. 11-1585）
o 棉布
o 保溫瓶（Thermos Co., Ltd. Cat.No.JMK-501）
o 冰袋（小）（Kyoritsu Co., Ltd. 冰袋霧凇 Cat.No. H-120）
o 冰袋（大）（shiro產(chǎn)業(yè) 冰袋R 500g 140 mm×250 mm、Cat.No. M250R-50）
o 泡沫箱（KARUX KC-3）
◆步驟
2細(xì)胞期胚胎的凍存
１. 用移液器（P-200）在培養(yǎng)皿上制作兩個(gè)１００μL M２的滴液（不要被流動(dòng)石蠟覆蓋）。 ２. 把凍存的胚胎從被流動(dòng)石蠟覆蓋著的培養(yǎng)液里移至到一個(gè)M2滴液里。
３. 更換新的微管，將胚胎從一個(gè)M2滴液移至另一個(gè)M2滴液里。
＊把從被流動(dòng)石蠟覆蓋的培養(yǎng)液滴液移至制作好的M2滴液里的胚胎移至到另一個(gè)M2的滴液時(shí)，盡量避開(kāi)附著流動(dòng)石蠟的滴液位置。
４. 往０.５mL EP管內(nèi)加入０.６mL的M２。
＊如果EP管頂部留有氣泡時(shí)，需輕拍出氣泡。
５. 從3個(gè)滴液里取出胚胎后放置在裝滿(mǎn)０.６mL的M２０.５mL EP管底部（一只EP管能放40個(gè)2細(xì)胞期胚胎）。
＊ 移動(dòng)胚胎后，在3個(gè)滴液里移液，確認(rèn)微管里是否殘留胚胎。
６. 合上EP管蓋子，并用封口膜包封。 ７. 在紙盒里裝入EP管、紐扣式溫度記錄儀和棉布后，蓋上盒蓋紙箱。 M２、紙盒、EP管、紐扣式溫度記錄儀和棉布全在室溫（20～25°C）下使用。
８. 紙盒保存在冷凍柜里（最長(zhǎng)可保存72小時(shí)）。
2細(xì)胞期胚胎的冷藏運(yùn)輸
與上述凍存步驟一樣，把EP管放進(jìn)紙盒（2細(xì)胞期胚胎的凍存1~7步）后，按以下操作包裝紙盒。
樣品是常溫的情況只需用保溫瓶和小冰袋，4~8°C凍存的樣品，則需要使用泡沫箱及大冰袋，包裝時(shí)動(dòng)作要迅速。
１. 把紙盒放進(jìn)保溫瓶?jī)?nèi)。
２. 再放進(jìn)兩個(gè)小冰袋至保溫瓶?jī)?nèi)。
３. 緊緊蓋上保溫瓶蓋。
４. 確認(rèn)瓶蓋蓋緊后，在泡沫箱內(nèi)鋪上大冰袋，然后放入保溫瓶（這時(shí)，請(qǐng)注意請(qǐng)勿倒放保溫瓶里裝有胚胎的EP管）。接著，保溫瓶?jī)蓚?cè)也放上大冰袋。最后用包裝帶固牢泡沫箱蓋。
５. 用快遞運(yùn)送，整個(gè)泡沫箱保存在（４～８°C）冷凍柜里。
６. 用快遞凍存運(yùn)輸最長(zhǎng)保存時(shí)間可達(dá)72小時(shí)。
＊冬季的室外氣溫會(huì)低至０°C以下，如果運(yùn)輸過(guò)程中泡沫箱長(zhǎng)時(shí)間放置在室外，2細(xì)胞期胚胎就會(huì)死亡。寄方應(yīng)首先聯(lián)系附近的快遞配送站，跟他們強(qiáng)調(diào)泡沫箱內(nèi)放有活細(xì)胞，請(qǐng)注意切勿放置在室外。
更改 : 2013.03.06 放有2細(xì)胞期胚胎的紙盒與冰袋放進(jìn)保溫瓶的順序互換，因?yàn)橄确疟蠓偶埡校辜埡须y以受到內(nèi)外氣溫差的影響，原頁(yè)面請(qǐng)點(diǎn)擊此處。
從冷藏運(yùn)輸試劑盒里取出2期細(xì)胞胚胎
1. 注入3滴100μL 的KSOM/AA在培養(yǎng)皿上，然后用流動(dòng)石蠟覆蓋。把培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱里孵育至少30分鐘。
2. 從保溫瓶里取出放有樣品的紙盒。
3. 紙盒在室溫下放置30分鐘。
注意:胚胎將在30分鐘內(nèi)沉在EP管底部。
4. 打開(kāi)紙盒，輕輕地取出棉花，一旦取出棉花后，要拿起裝有胚胎的EP管，并打開(kāi)蓋子。
5. 用灌注凝膠槍頭收集EP管中M2上清液200μL，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿的邊緣。
6. 用灌注凝膠槍頭小心地把全部M2包括在EP管底部的胚胎移至培養(yǎng)皿的中心。 注意:為了方便操作，在使用移液器時(shí)盡量避免吸入空氣。
7. 從M2里采集的胚胎，分別轉(zhuǎn)移至3個(gè)100μL KSOM/AA 滴液中，進(jìn)行清洗。
注意:如果不能移走所有的胚胎，可以用培養(yǎng)皿邊緣上的200μL M2滴液來(lái)清洗EP管內(nèi)部。
8. 然后把胚胎移植到代孕小鼠的輸卵管內(nèi)。
注意: 理論上，在胚胎清洗完至移植到代孕小鼠體內(nèi)的這一過(guò)程需在短時(shí)間內(nèi)完成。 (請(qǐng)參考“胚胎移植入輸卵管”)
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