小鼠生殖工程學技術——7凍存小鼠胚胎
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小鼠生殖工程學技術——7凍存小鼠胚胎便捷的玻璃化冷凍保存小鼠胚胎
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◆材料
1. 1M DMSO(Cat. CSR-R-T072)
2. DAP213(Cat.# CSR-R-T073)
3. 培養皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)
4. 過濾裝置(Millex-GV 0.22μm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)
5. 灌注凝膠槍頭 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)
6. 移液管
7. 凍存管(Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, Japan is recommended. If you cannot get it, use 366656; NUNC.)
8. 微管
9. 凍存架
10. Nalgene 冷卻器 (5115-0012; NALGENE, USA)
11. 液氮
12. 顯微鏡.
13. 0.25 M 蔗糖
14. KSOM/AA
15. 液體石蠟
◆步驟
冷卻器和凍存管的準備
1. 使用前一天，把冷卻器放置-20°C 的冷藏庫里。
2. 在實踐玻璃化步驟的前10分鐘，從冷藏庫里取出冷卻器。
3. 凍存管放入冷卻器里 (5115-0012; NALGENE, USA)。 一只凍存管能裝大約40個胚胎，換而言之，當你想裝120個胚胎時，你需要放3只凍存管在冷卻器里。
4. 開始實驗之前，請檢查凍存管內的溫度是否為0°C 。
玻璃化
1. 過濾1M DMSO后，在培養皿上滴入4個滴液（~100μL / 個）。其中一滴用于清洗從培養基里采集的胚胎，其余三個用于存放已清洗的胚胎。
2. 把全部胚胎放入其中一個滴液里，清洗沾有培養基的胚胎。清洗后的胚胎平均放進其余的3個滴液里。這3個等份的胚胎最終將會轉移至儲存小瓶里。
例如，采集了120個胚胎，分成3個等份，每一等份40個，這些胚胎首先會一起放到清洗的滴液里，然后再分成3份放進3個滴液里。
3. 使用20μL移液管和灌注凝膠槍頭 , 轉移5μL 的1M DMSO溶液的胚胎至凍存管內。轉移后，立即將凍存管放置0°C 冷卻器內5分鐘。
注意:凍存管可以放在0°C 冷卻器中超過5分鐘 (<20分鐘)。
注意:如果胚胎都集中在滴液的中央，就能把全部胚胎輕易地吸進5μL 的M DMSO 溶液中。
4. 在0°C 下，往凍存管里加入45μL 的凍存液(DAP213) ，并在在0°C冷卻器里靜置5分鐘。
注意:加入DAP213凍存液后，不要把低溫管的塞子擰得太緊，否則胚胎復蘇后很難快速轉移。
5. 迅速將凍存管放到凍存架上，然后直接放進液氮里。
參考文獻
【1】 Nakagata N. 1989. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. J. Reprod. Fert. 87: 479-483.
【2】 Nakagata N. 1993. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro
fertilization between cryopreserved gametes. J. Reprod. Fert. 99: 77-80.
【3】 Nakagata N. 1995. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice. Exp. Anim. 44: 1-8.
【4】 Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse
embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234. 118.
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