小鼠生殖工程學技術——9CARD以外的方法凍存的精子進行體外受精
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回到小鼠生殖工程凍存及培養試劑
◆材料
1、 用CARD以外的方法來凍存精子（凍存管或者吸管）2、 過量排卵處理后的雌性小鼠3、FERTIUP?精子孵育培養基（Cosmo Bio Co., Ltd）4、CARD MEDIUM?（Cosmo Bio Co., Ltd）5、mHTF6、 恒溫水箱（37°C）7、 復蘇精子用的漂浮裝置8、 剪刀9、 吸水紙10、1.5 mL EP管（微型離心管）（Quality Scientific Plastics 1.5ml Graduated Microcentrifuge Tube with Flat Top Cap, Natural Cat.No. 509-GRD-Q）11、離心分離機12、電動移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）13、培養皿（Corning 35mm X 10mm Cat.No.430588）14、流動石蠟（nacalai Cat.No.26137-85）15、CO2培養箱
◆方法
制作復蘇精子的漂浮裝置
1、50ml的離心管與泡沫組合成漂浮裝置如下圖，用于精子復蘇。
復蘇精子前的準備
1、準備恒溫水箱（37°C）2、用37°C的溫水裝滿漂浮裝置的離心管后，放進水箱里，裝置就會上浮，如下圖
3、在復蘇精子前30分鐘，制作精子預孵培養皿（100μl FERTIUP? 精子預孵培養基滴液），靜置在培養箱里。
4、采集卵子前10分鐘，制作一個采集卵子用的培養皿（200μL的CARD MEDIUM?滴液），靜置在培養箱里。
※根據體外受精用的精子的不同，CARD MEDIUM?調試方法也不同。具體請參考操作說明書。
5、制作清洗卵子用的培養皿（80μLmHTF滴液4個），在培養箱里靜置30分鐘以上。
未受精卵的采集和培養
1、讓進行了過量排卵處理的雌性小鼠在注射了hCG 的15~17個小時后安樂死，然后把卵子塊放進采集卵子用的培養皿的CARD MEDIUM?滴液里（一滴液里可放3~10只雌性小鼠的卵子塊）。
※ 從雌性小鼠安樂死后到將輸卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM?滴液這一過程要在極短時間內完成（30秒內）。
※一個人實驗的情況下，請不要一次性安樂死數只雌性小鼠，應該一只只地進行，并迅速采集卵子。2、未受精卵在采集卵子培養皿里預孵培養60分鐘。
解凍精子
1、從液氮儲存器中取出樣品（放有凍結精子的試管或吸管），迅速放置37°C恒溫水箱里。精子在凍存管的情況下，要迅速打開管蓋，倒掉管內的液氮，然后浸泡在恒溫水箱內。精子在吸管的情況下，要迅速將吸管放置恒溫水箱的漂浮裝置里。
2、把樣品內的所有精子懸濁液移置到1.5ml的EP管內，慢慢加入37°C的mHTF （1.2mL），輕輕攪拌后進行離心（300g 5分鐘 室溫）；
3、去除澄清層（mHTF 里含有約30μL的顆粒會沉淀在試管底部）。然后加入37°C的FERTIUP?精子預孵培養基70μL，輕輕搖勻）
4、用槍頭吸取EP管內的全部液體，注射進精子預孵培養皿的滴液里，進行30分鐘的預孵培養。
受精
1、用槍頭吸取預孵后的未受精卵時，盡量少吸入培養液，然后把未受精卵注射到含有復蘇精子的精子預孵培養皿的滴里，進行受精。
2、受精3小時后，在清洗卵子培養皿的mHTF滴液里清洗正常形態的卵子，培養至次日。
3、受精6個小時后，仔細觀察卵子，去取單性生殖卵（卵子細胞內只有1個原核），其余卵子培養至次日。4、次日，只把發育到2細胞期的胚胎移到清洗卵子用的培養皿內留下的滴液里，數完胚胎數后，就能將其用于移植或者凍存。
參考文獻
[1] Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Takeshita Y., Nakamuta Y., Umeno T., and Tsuchiyama
S. 2014. RescueIn VitroFertilization Method for Legacy Stock of Frozen Mouse Sperm.J Reprod Dev.?60(2): 168-171
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