小鼠生殖工程學技術(shù)——2精子復蘇
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回到小鼠生殖工程凍存及培養(yǎng)試劑
◆材料
1、 過量排卵處理后的雌性小鼠2、 FERTIUP?精子預孵培養(yǎng)基（Cosmo Bio Co., Ltd）3、 CARD MEDIUM?（Cosmo Bio Co., Ltd）4、 mHTF（Cosmo Bio Co., Ltd）5、 槍頭（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics）6、 培養(yǎng)皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）7、 與吸管配用的注射器8、 恒溫水箱（37°C）9、 精子復蘇用的Float10、自動移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）11、CO2培養(yǎng)箱12、剪刀13、吸水紙
◆方法
制作復蘇精子的漂浮裝置
1、50mL的離心管與泡沫組合成漂浮裝置如下圖，用于精子復蘇。
復蘇精子前的準備
1、 準備恒溫水箱（37°C）2、 用37°C的溫水裝滿裝置里的離心管后，放進水箱里，漂浮裝置就會浮起來，如下圖
3、 在復蘇精子前30分鐘，制作精子預孵培養(yǎng)皿（滴入90μL FERTIUP?精子預孵培養(yǎng)基），準備靜置在培養(yǎng)箱里。
4、 收集卵子的前10分鐘，制作受精用的培養(yǎng)皿（滴入一個90μL CARD MEDIUM?滴液，靜置在培養(yǎng)箱。
※根據(jù)體外受精用的精子的不同，CARD MEDIUM?調(diào)試方法也不同。具體請參考操作說明書。
5、 制作清洗卵子用的培養(yǎng)皿（80μL mHTF滴液4個），在培養(yǎng)箱里靜置30分鐘以上。
采集卵子
1、 讓進行了過量排卵處理的雌性小鼠在注射了hCG 的15~17個小時后安樂死，然后把卵子放進受精用的培養(yǎng)皿的CARD MEDIUM?滴液里（一滴液里可放2~3只小鼠的卵子）
※ 從雌性小鼠安樂死后到將輸卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM?滴液這一過程要在極短時間內(nèi)完成（30秒內(nèi)）
※一個人實驗的情況下，請不要一次性安樂死數(shù)只雌性小鼠，應該一只只地進行，并迅速提取卵子。2、采集卵子后，把受精用培養(yǎng)皿放進 CO2培養(yǎng)箱里預孵培養(yǎng)30~60分鐘。
精子的復蘇
1、用鉗子取出液氮儲存器里的吸管，在空氣中逗留5秒，立刻放置37°C恒溫水箱的裝置里，進行加熱。
要點：為確保在37°C下加熱，將吸管里的凍存精子朝下方放進浮動物里。
要點：凍融的精子會因處在的周圍環(huán)境的變化而變?nèi)酰诰舆\動前，從高粘性精子保存液里移至低粘性培養(yǎng)基（FERTIUP?精子預孵培養(yǎng)基），復蘇后的精子的運動能力不會完全恢復。為了能讓復蘇后的精子在37°C加熱5分鐘以上精子就能很好地運動，請讓試管在37°C溫水中靜置10分鐘后，將精子懸濁液移至預孵培養(yǎng)基中(FERTIUP?精子預孵培養(yǎng)基)。2、 加熱后，從37°C恒溫水箱里取出試管，用吸水紙把試管表面的水分吸干。
取出精子懸濁液進行預孵
1、 切斷吸管內(nèi)的mHTF與封口的中間處（要提前拉出注射器的內(nèi)筒）
2、 把剪斷后的吸管插入到注射器里。
3、 吸管插入注射器后，吸管內(nèi)氣壓變高，為了釋放氣壓，需要轉(zhuǎn)動一次三路活塞的一個旋塞。
4、旋塞往上回正后，切斷精子懸濁液與封口中間處。
5、慢慢按下注射器內(nèi)筒，只把精子懸濁液注射進精子預孵培養(yǎng)皿的滴液中。
6、 往培養(yǎng)箱內(nèi)放入5個精子預孵培養(yǎng)皿，培養(yǎng)30分鐘。
要點：精子預孵培養(yǎng)皿需要靜置在培養(yǎng)箱里直到精子已完全復蘇。請注意不要在精子完全復蘇前搖動培養(yǎng)皿，否則精子的運動性能就不能完全得到恢復。
受精
1、 用槍頭（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics），吸取預孵后的精子懸濁液10μl，注射進含有卵子的受精培養(yǎng)皿的CARD MEDIUM?滴液里。（受精）2、 受精后，把受精用的培養(yǎng)皿放進培養(yǎng)箱里進行3小時培養(yǎng)。
要點：受精用的精子懸濁液是從集合優(yōu)良精子的預孵培養(yǎng)液滴液的邊緣里收集。（請參閱下圖
要點：一個滴液里可收集3~4次精子懸濁液。
要點：精子懸濁液要注射進受精用培養(yǎng)皿的滴液里，使卵子充分接觸精子懸濁液。
3、 受精后3小時 ，在清洗卵子用培養(yǎng)皿的滴液清洗正常形態(tài)的卵子，培養(yǎng)至次日。
※清洗前，由于卵子的透明帶上會附著許多精子，所以用裝上槍頭的自動移液器，把受精用培養(yǎng)皿的CARD MEDIUM?滴液移液20~30次后，才清洗卵子。
※清洗的時候，請注意，盡量不要把CARD MEDIUM?帶入到清洗卵子用培養(yǎng)皿的滴液里。
4、 受精6個小時后，仔細觀察卵子，摘取單性生殖卵（卵子細胞內(nèi)只有1個原核），培養(yǎng)至次日。5、 次日，只把發(fā)育到2細胞期的胚胎移到清洗卵子用的培養(yǎng)皿內(nèi)留下的滴液里，數(shù)完胚胎數(shù)后，就能將其用于移植或者凍存。
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