小鼠生殖工程學技術——1精子的凍存
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回到小鼠生殖工程凍存及培養試劑
◆材料
1、12周以上的雄性小鼠2、noesu剪刀（森田制造所 電話03-3811-9730 特別訂制品）
3、FERTIUP? 精子凍存液（Cosmo Bio Co., Ltd）4、mHTF5、培養皿（Corning 35mm X 10mm Cat.No.430588）6、黃色槍頭（BM醫療器 Cat.No.110-96R）7、填充精子用的吸管(My Science Cryo Bio System 0.25mL cotton-plugged Sperm StrawsReferences.010261 or My ScienceFrance Cassou type Straws (AAA201) 0.25mL Cat.No.005565）8、配套吸管用的注射器9、自動移液器（GILSON PIPETMAN P-10 P-100）10、加熱板（37℃）11、封口包裝機（富士MPULSE 專業包裝機器Cat.No.P-200）12、凍結精子用的吸管13、Triangle Cassette14、液氮儲存器和干式液態氮筒15、剪刀
◆步驟
制作凍存精子懸浮裝置
1、3厘米厚的泡沫切成圓柱狀，塞進50mL的注射器外筒內（泰爾茂Cat. No.SS-50ESz）。
2、用火加熱50mL注射器前端，來封堵前端口。
3、用鐵絲把注射器固定在50cm的玻璃棒上。
※該裝置也可從Cosmo Bio直接購買
準備吸管及制作配套吸管的注射器
1、 在填充精子用的吸管中部貼上標簽，剪下棉塞處。2、 把1mL注射器（泰爾茂Cat. No.SS-01T）、三方活塞（泰爾茂 Cat.No.TS-TR1K）、橡膠管?塑料管（DRUMMOND Cat.No.2-040-000）以及硅帽組裝成如下圖3、 精子填充用的吸管的棉塞一側插進注射器的硅帽里使用。
制作精子懸濁液
1、在培養皿上制作凍存滴液（FERTIUP?精子凍液：60μL），用流動石蠟覆蓋滴液；
2、往被覆蓋的滴液里再注射進凍存液（FERTIUP?精子凍液：60μL）,得到一個更大的滴液。
※制作后的培養放置在37℃的加熱板上至使用時才拿出。
3、讓成年雄性小鼠安樂死，把收集的左右附睪尾放置過濾紙上，在實體顯微鏡下小心地取出血液和脂肪。
4、在培養皿上少量的FERTIUP?精子凍存液的滴液里小心地清洗附睪尾。
5、FERTIUP?精子凍存液的滴液里放進2個附睪尾，用noesu剪刀在附睪尾處剪開5~6切痕。
※只有一個附睪尾時，只需60μLFERTIUP?精子凍存液的滴液。
6、培養皿在37℃加熱板上靜置3分鐘，為了得到均勻的精子懸濁液，需每分鐘攪拌一次。
精子懸濁液填充吸管
1、 把填充精子懸濁液的吸管插進吸管配套用的注射器內，往吸管注入約100μL的mHTF。※一根吸管只能注入10μL的精子懸濁液，如果把吸管就這樣浸泡在液氮中，吸管就會浮起來，所以mHTF充當砝碼，讓吸管沉浸在液氮底部。
2、注入mTHF后，吸管前端需留有15mm的空隙。3、用黃色槍頭吸取培養皿上10μL的精子懸濁液，然后注射進吸管里。
4、 接著再留15mm空隙，用封口機封住吸管端口。
※拉開注射器內筒，觀察精子懸濁液和mHTF的狀態來確認是否已完全密封。如果精子懸濁液和mHTF移動了，就需再次封口。5、 從注射器內，移走吸管，用封口機把吸管的另一側封住。6、 重復1~5個步驟，制作10~11根填充了精子懸濁液的吸管。
凍存（使用液氮儲存）
1、 吸管內精子懸濁液一側朝下放進浮物里。2、 浮物浮在液氮面上，大概靜置10分鐘后，讓浮物浸泡在液氮里。
3、 撈起裝滿了液氮的浮物，把吸管移至預先在液氮內冷卻的Triangle cassette，存放在液氮里
凍存（使用干式液態氮筒）
1、 吸管內精子懸濁液一側朝下，放進Triangle cassette內。2、 從干式液態氮筒里取出一個容器（金屬制造的筒），然后把Triangle cassette翻入容器里，蓋上干式液態氮筒的蓋子。
※在使用干式液態氮筒的前一天，筒內裝滿液氮，讓筒內的吸附劑充分吸收液氮，吸收不了的多余的液氮，使用前之前倒掉。
3、靜置10分鐘
※用干式液態氮筒凍存精子時，可以直接運輸放進干式液態氮筒里的精子。
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