DH5α感受態(tài)細胞-重組克隆表達-分子生物學(xué)
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| 英文名稱 | E.coli DH5α Competent Cells |
|---|---|
| 儲存條件 | -70℃保存，必須加干冰運輸。自收貨之日起液氮保存至少一年，-70℃保存至少6個月。 |
| 外觀（性狀） | 干冰運輸，單加10kg干冰費 |
| 單位 | 袋 |
本公司生產(chǎn)的DH5α感受態(tài)細胞是采用大腸桿菌DH5α菌株經(jīng)特殊工藝制備得到，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達108，-70℃保存3-5個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
基因型: supE44△lacU169（φ80 lacZ△M15）hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1
特 點: 一種用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷的抑制型菌株。其φ80 lacZ△M15基因的產(chǎn)物可與pUC載體編碼的 β-半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)β互補，可用于藍白斑篩選。
操作方法：（以下操作均按無菌條件的標準進行）
1、將感受態(tài)細胞置于冰上融化，以下實驗以100ul感受態(tài)細胞為例。
2、向感受態(tài)細胞懸液中加入需轉(zhuǎn)化的目的DNA，注意目的DNA的體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴放置30分鐘。
3、將離心管置于42℃水浴中60-90秒，然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中放置2-3分鐘，注意不要搖動離心管。
4、向離心管中加入500ul無菌無抗的SOC或LB培養(yǎng)基，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)1小時。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標記基因表達，使菌體復(fù)蘇。
5、取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布含相應(yīng)抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。涂布用量可根據(jù)具體實驗來調(diào)整，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取100ul左右的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300ul的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板。過多菌液可以抑制細菌生長。如果預(yù)計的克隆較少，可通過離心后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少，可以將剩下的菌液再涂布新的平板。
注意事項：
1、感受態(tài)細胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會降低。
2、實驗過程中應(yīng)嚴格無菌操作，防止其它DNA或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來影響。
3、轉(zhuǎn)化時，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA量過多或體積過大反而會降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時DNA體積要小于感受態(tài)細胞體積的十分之一。
4、轉(zhuǎn)化率的計算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。
5、為防止轉(zhuǎn)化實驗不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到最低。
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