新型親和性外泌體純化法與外泌體高靈敏度檢測(cè)應(yīng)用
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新型親和性外泌體純化法與外泌體高靈敏度檢測(cè)應(yīng)用◆前言
外泌體是各種細(xì)胞外泌的直徑在30-100nm之間的膜囊泡。因外泌體內(nèi)含mRNA、microRNA等核酸和蛋白質(zhì)對(duì)相鄰細(xì)胞具有交換信息的功能。作為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的通訊工具和作為癌等各種疾病的生物標(biāo)記話題比較熱議[1][2]。因此，這幾年各領(lǐng)域關(guān)于外泌體研究很廣泛，但是在現(xiàn)實(shí)的外泌體實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展中，關(guān)于需要改進(jìn)的課題存在很多。例如，在外泌體純化方法中超離心分離法和多聚體沉淀法（市售試劑盒），容易混入多種雜質(zhì)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中增加了很多障礙。另一方面，抗體親和性和密度梯度離心可獲得高純度外泌體，但是不能獲得完整狀態(tài)。因此存在著不能分析外泌體完整狀態(tài)下的生理功能。作為外泌體進(jìn)一步檢測(cè)方法，免疫印跡和ELISA被廣泛應(yīng)用。但是存在著需要大量外泌體樣本和標(biāo)記蛋白量少導(dǎo)致檢測(cè)較困難的問題。
因此本文為了解決外泌體實(shí)驗(yàn)技術(shù)中各種課題，我們關(guān)于開發(fā)的新型外泌體分析工具進(jìn)行了說明。
◆磷脂酰絲氨酸親和性新型外泌體純化法
外泌體膜雖然含有分泌細(xì)胞源蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，但眾所周知磷脂酰絲氨酸（PS）在活細(xì)胞通過翻轉(zhuǎn)酶作用導(dǎo)向細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，也會(huì)暴露在外泌體膜外側(cè)[3]。另外，被作為通過巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡的吞噬受體T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4(Tim4)蛋白質(zhì)通過細(xì)胞外域IgV域與含有鈣離子的PS結(jié)合[4]。以上述知識(shí)為參考，我們利用Tim4固化磁珠，在鈣離子存在下捕捉培養(yǎng)上清和血清等樣品中的外泌體，再添加螯合劑可純化外泌體，這種劃時(shí)代外泌體純化方法是和金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)系免疫學(xué)華山教授共同開發(fā)，并取得了成功。[5]并且MagCapture™Exosome Isolation Kit PS實(shí)現(xiàn)了比以前的外泌體純化法更加簡(jiǎn)捷地純化高純度完整狀態(tài)的外泌體。這是迄今為止取代黃金標(biāo)準(zhǔn)超速離心法的新型外泌體純化法。（圖1）
◆PS Capture™ExosomeELISA Kit的特點(diǎn)和使用案例
PS Capture™Exosome ELISA Kit是Tim4蛋白通過PS和外泌體親和性結(jié)合的應(yīng)用ELISA試劑盒。本試劑盒將外泌體表面標(biāo)記蛋白的抗體固相化，相比以前的ELISA法，可高靈敏度檢測(cè)外泌體。此方法是將培養(yǎng)上清和血清等含有外泌體的樣本添加到Tim4蛋白包被的干板，在鈣離子存在下捕獲外泌體，通過對(duì)外泌體表面標(biāo)記蛋白質(zhì)進(jìn)行一抗結(jié)合反應(yīng)和二抗結(jié)合反應(yīng)，從而完成對(duì)外泌體檢測(cè)（圖2）。此外，本試劑盒附加了可作為一抗的小鼠抗CD63單抗，但除此之外，如果測(cè)定外泌體表面標(biāo)記的話，需提前準(zhǔn)備小鼠源一抗方可檢測(cè)外泌體。
本試劑盒最大特點(diǎn)就是實(shí)現(xiàn)了比免疫印跡和已有的Exosome ELISA產(chǎn)品更高靈敏度檢測(cè)外泌體。首先，為了用本試劑盒和免疫印跡法比較檢測(cè)靈敏度，在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中需要檢查外泌體檢測(cè)極限值（圖3a）。結(jié)果顯示，以人結(jié)腸癌細(xì)胞的COLO201細(xì)胞源純化外泌體作為樣本通過抗CD63單抗進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)出蛋白質(zhì)含量75ng的外泌體。然后，用本試劑盒檢測(cè)純化的白血病源細(xì)胞株K562細(xì)胞以及COLO201細(xì)胞源外泌體的ELISA檢測(cè)極限值，K562細(xì)胞源外泌體的檢測(cè)極限值為49.9pg，COLO201細(xì)胞源外泌體檢測(cè)極限值為10.9pg。免疫印跡實(shí)驗(yàn)實(shí)際具有1000倍以上的檢測(cè)靈敏度（圖3b）。另外，已有Exosome ELISA產(chǎn)品的靈敏度在數(shù)ng~μg之間（參考各產(chǎn)品手冊(cè)），但是本試劑盒通過PS與Tim4蛋白親和性結(jié)合比原來外泌體表面標(biāo)記抗體包被ELISA法在靈敏度上高出100倍以上。
最后，本試劑盒的使用案例為各種細(xì)胞源外泌體表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)分析。用13種細(xì)胞培養(yǎng)上清純化的外泌體各1ng，通過外泌體標(biāo)記蛋白CD9/CD63/CD81的抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)（圖4）。結(jié)果顯示，在各外泌體中表面標(biāo)記蛋白的存在比例因來源細(xì)胞不同而存在明顯差異。有的細(xì)胞株分泌不具有特定標(biāo)記蛋白的外泌體，外泌體異質(zhì)性高且明顯的數(shù)據(jù)說明本試劑盒的ELISA系統(tǒng)是十分優(yōu)質(zhì)的。
◆結(jié)論
綜上所述，利用Tim4蛋白的PS親和性原理的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS實(shí)現(xiàn)了可簡(jiǎn)便高靈敏度純化外泌體。PS Capture™ Exosome ELISA Kit是高靈敏度檢測(cè)外泌體的劃時(shí)代產(chǎn)品。為此，通過使用本試劑盒對(duì)原方法混入雜質(zhì)后外泌體標(biāo)記蛋白確認(rèn)分類問題和至今為止免疫印跡實(shí)驗(yàn)以及已有Exosome ELISA產(chǎn)品微量表面標(biāo)記蛋白檢測(cè)困難等問題都可解決。今后本公司將會(huì)利用Tim4蛋白的PS親和性能開發(fā)外泌體研究相關(guān)試劑。真誠(chéng)希望這些產(chǎn)品為外泌體研究發(fā)展做出貢獻(xiàn)。
參考文獻(xiàn)
[1] Tkach, M. et al. : Cell, 164, 1226 （2016）.
[2] Raimondo, F. et al. : Proteomics,11, 709 （2011）.
[3] Trajkovic, K. et al. : Science,319 （5867）, 1244 （2008）.
[4] Miyanishi, M. et al. : Nature, 450, 435 （2007）.
[5] Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 （2016）.
◆相關(guān)產(chǎn)品
1. Exosome外泌體試劑盒
2. PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD）
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