BIA Separations 150.8501-1.4 CIMac? pDNA-0.3 Analytical Column (1.4 μm)
BIA Separations 110.5118-2 CIMac PrimaS? 0.1 mL Analytical Column (2 μm)
ADS BIOTEC DNA-99-3510 DNASep? Cartridge – DNA Separation Column
強大而精確的色譜分析方法是高效開發(fā)mRNA生產(chǎn)過程的關(guān)鍵。本文mRNA分析平臺是BIA Separations公司PATfix?分析及純化工作平臺家族的新成員PATfix? mRNA分析平臺，可實現(xiàn)mRNA工藝開發(fā)（PD）和生產(chǎn)過程中的在線監(jiān)測，尤其是IVT反應(yīng)成分（核苷酸和加帽試劑）以及最終產(chǎn)品的表征和定量，精準(zhǔn)針對mRNA原液制備過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為mRNA藥物的生產(chǎn)提供關(guān)鍵支持，幫助其加速藥物的開發(fā)。
三種方法
下面分別介紹PATfix? mRNA分析平臺三種不同的分析方法，在PATfix? mRNA分析平臺中使用三種不同的色譜柱，支持mRNA工藝開發(fā)和最終產(chǎn)品的表征和定量。
方法1:使用CIMac PrimaS?進(jìn)行
IVT反應(yīng)監(jiān)測
使用CIMac PrimaS?色譜柱（貨號：110.5118-2）和PATfix?平臺中的方法，可以實現(xiàn)對IVT反應(yīng)成分的全面在線分析，該方法能夠定量整個IVT反應(yīng)中單個核苷酸、加帽試劑和mRNA的生成（1）。該方法能夠快速優(yōu)化IVT反應(yīng)，對mRNA的生產(chǎn)、規(guī)模擴大、技術(shù)轉(zhuǎn)移或其他工藝開發(fā)活動至關(guān)重要。該方法對IVT主要成分的定量限（LOQ）是：核苷酸為6 ng，mRNA為12 ng。1中所示的兩個mRNA洗脫峰是兩種不同的mRNA異構(gòu)體。
1.PrimaS色譜法分離關(guān)鍵的IVT成分PrimaS分析方法能夠?qū)蝹€核苷酸進(jìn)行定量，包括以單個峰洗脫的CTP和UTP。估算UTP和CTP濃度的方法利用了這兩種核苷酸在260 nm和280 nm處的紫外吸收面積之比的差異（2）。
2.CTP(1.04)和UTP(2.27)的 260/280 比值差異可用于定量PrimaS分析方法允許在線監(jiān)測優(yōu)化和非優(yōu)化IVT條件下的反應(yīng)動力學(xué)。3和4分別為通過CIMac PrimaS色譜柱分析的兩組不同IVT反應(yīng)條件下mRNA產(chǎn)生的示例。
3.非優(yōu)化IVT條件下IVT反應(yīng)監(jiān)測，終點mRNA濃度為1.5 mg/mL
4.在優(yōu)化的IVT條件下（終點mRNA濃度為7.9 mg/mL）的IVT反應(yīng)監(jiān)測
方法2:使用CIMac? Oligo dT進(jìn)行mRNA定量
使用CIMac? Oligo dT（目錄號：110.1219-2）和PATfix?平臺中的方法，可以進(jìn)行mRNA定量。CIMac? Oligo dT是一種親和柱，將Oligo dT連接到整體柱表面，與mRNA的聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)合。當(dāng)mRNA在洗脫步驟中洗脫時，所有沒有polyA尾的其他物質(zhì)（核苷酸、加帽試劑、DNA模板、酶）均在非結(jié)合條件下（流穿）洗脫。5中mRNA的LOQ值為10 ng。
5.使用Oligo dT色譜柱監(jiān)測IVT樣品的色譜。未結(jié)合的物質(zhì)如核苷酸、質(zhì)粒、加帽試劑、酶和非聚腺苷酸化的mRNA在非結(jié)合條件下被洗脫。多腺苷酸化的mRNA在洗脫步驟中被洗脫。
使用CIMac?Oligo dT的分析方法，按照EMA和FDA的指南進(jìn)行了驗證，是一種精確和快速的方法，可以對純的和復(fù)雜的樣品中的多腺苷酸化mRNA進(jìn)行定量分析，精確度達(dá)到或高于90%（6）。
6.方法精確顯示，比較測量值與標(biāo)稱（通過Nanodrop獲得）mRNA值。使用6條不同校準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)確定誤差線。
方法3:使用CIMac? SDVB進(jìn)行
mRNA完整性表征和污染物檢測
CIMac? SDVB柱是一種反相柱，與離子配對試劑一起使用。在高溫下使用乙jing梯度分析的方法可以按大小進(jìn)行分離（7），同時檢測雜質(zhì)，重點是dsRNA檢測（8）。SDVB分析法對RiboRuler高范圍ssRNA進(jìn)行大小分離
7.CIMac SDVB色譜柱根據(jù)Thermo Scientific? RNA High Range ladder的大小進(jìn)行分離
SDVB分析法檢測dsRNA雜質(zhì)在最終的mRNA產(chǎn)物中，最關(guān)鍵的雜質(zhì)之一是dsRNA。SDVB分析法可以單次色譜分離該雜質(zhì)(8)。dsRNA的分離用J2斑點免疫印跡實驗證實。
8.含有可檢測含量的dsRNA的mRNA樣品的色譜
SDVB分析法是一種穩(wěn)定的檢測mRNA的方法
mRNA的完整性可以用CIMac? SDVB柱來研究，主峰的前沿可能表示mRNA的降解片段或來自IVT反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
強制降解研究（1 M NaOH，10分鐘）的mRNA藥物物質(zhì)（4000 nt）導(dǎo)致了可觀察到的主峰前移，這是由于在主要的、完整的mRNA之前出現(xiàn)了一些片段。如9所示，這些較短的片段是mRNA降解的結(jié)果。
?
Bio-Rad伯樂官網(wǎng) |伯樂授權(quán)代理 |伯樂ddPCR| 伯樂Aminex| 伯樂層析填料色譜柱是專業(yè)的授權(quán)總代理區(qū)域代理經(jīng)銷平臺。
? 如需詢價，請加客服QQ：1749072012 、客服微信：jinshanbio，或發(fā)送郵件到1749072012@qq.com
? 平臺為生命科學(xué)研究相關(guān)領(lǐng)域提供一站式耗材試劑儀器解決方案和采購服務(wù)，數(shù)據(jù)資源基于CC協(xié)議。
? 本文地址：
http://www.gamefang.cn/thread-62593.htm
QQ:1749072012