核蛋白提取試劑盒-蛋白提取/定量-蛋白與免疫
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核蛋白提取試劑盒| 別名 | 細胞核蛋白提取試劑盒 |
|---|---|
| 英文名稱 | Nuclear Protein Extraction Kit |
| 儲存條件 | 提取試劑4℃保存，PMSF于-20℃保存。 |
| 單位 | 瓶 |
產(chǎn)品簡介： 本核蛋白提取試劑盒提供了一種簡單、方便的從培養(yǎng)細胞或新鮮組織中抽提核蛋白的方法。整個過程只需約60分鐘就可以將核蛋白和漿蛋白從細胞中分離出來。得到的蛋白可以用于Western blot等實驗。本試劑盒通過漿蛋白抽提試劑使細胞膨脹破裂，釋放出胞漿蛋白，再通過離心得到細胞核。然后通過核蛋白抽提試劑抽提得到細胞核蛋白。本試劑盒可以抽提50/100個樣品（每個樣品約2×106個Hela細胞或40mg組織）。
規(guī)格：50T/100T
產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑盒組成 | 50T | 100T |
漿蛋白抽提試劑 | 25ml | 50ml |
核蛋白抽提試劑 | 5ml | 10ml |
PMSF（100mM） | 300μl | 1ml |
保存：核/漿蛋白抽提試劑4℃保存，PMSF于-20 ℃保存。
操作方法：
裂解蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進行。
一、對于體外培養(yǎng)細胞：
1．根據(jù)用量取適當(dāng)?shù)臐{蛋白抽提試劑和核蛋白抽提試劑加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。PMSF需現(xiàn)用現(xiàn)加，若目標蛋白含有豐富的半胱氨酸，可以在兩種蛋白抽提液中加入DTT至終濃度0.5mM。
2．對于貼壁細胞，去除培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，用細胞刮刀收集細胞，或用EDTA消化后吹打下細胞（最好不用胰酶硝化，以免胰酶消化目的蛋白）。500 g離心2～3分鐘收集細胞，吸盡上清留下沉淀備用。
3．對于懸浮細胞：用PBS洗一遍，500 g離心2～3分鐘收集細胞，吸盡上清，留下細胞沉淀備用。
4．每20μl細胞沉淀加入200μl漿蛋白抽提試劑（2×106個細胞沉淀的體積約20μl或40mg）。
5．用移液器吹打或高速渦旋15秒（可適當(dāng)延長），必須使細胞沉淀完全分散開成單細胞懸液。細胞沉淀分散不完全會導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量降低。
6．冰浴10分鐘。
7．最高轉(zhuǎn)速劇烈渦旋10秒，4℃12000～16000g離心10分鐘。
8．上清即為抽提得到的細胞漿蛋白，立即吸取上清至預(yù)冷的樣品管中備用，進行后續(xù)的PAGE、Western等實驗，但蛋白濃度較低，可根據(jù)需要進行相應(yīng)濃縮。
9．沉淀即為細胞核，要完全吸盡殘余的上清（避免細胞漿蛋白的污染），加入50-100μl核蛋白抽提試劑。
10．用移液器吹打或高速渦旋15秒（可適當(dāng)延長）至沉淀完全分散，冰浴10分鐘。
11．最高轉(zhuǎn)速劇烈渦旋10秒，4℃12000～16000g離心10分鐘。12．立即吸取上清至預(yù)冷的樣品管中，此即為抽提得到的細胞核蛋白。可進行后續(xù)實驗或-70℃凍存。對于組織樣品：把組織稱重后，盡可能切成非常細小的碎片，按每50mg組織加入200μl-500μl PBS，用勻漿器冰上勻漿制成細胞懸液，500 g離心2～3分鐘收集細胞，吸盡上清，收集沉淀。加入200μl漿蛋白抽提試劑后接上述步驟5。
注意事項：
1．裂解得到的蛋白樣品，由于含有較高濃度的去垢劑干擾，不能用Bradford法測定蛋白濃度，可以選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白定量試劑盒(貨號PC0020)測定蛋白濃度。
2．對于組織樣品，本試劑盒適用于新鮮組織，對凍存組織抽提效果較差。
3．為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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