非變性組織/細胞裂解液-蛋白提取/定量-蛋白與免疫
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非變性組織/細胞裂解液| 英文名稱 | Native lysis Buffer |
|---|---|
| 儲存條件 | 4℃保存，有效期 1 年，PMSF置于-20℃保存 |
| 單位 | 瓶 |
非變性組織/細胞裂解緩沖液內含非離子型去垢劑，能裂解細胞并在非變性條件下釋放胞漿蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。非變性條件下的裂解蛋白產物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗體結合或酶學活性，因此適宜于進行免疫共沉淀。另外，有些抗體對非變性蛋白具有更高的結合能力或只能識別非變性蛋白的抗原位點，這種情況應該使用非變性裂解。
使用說明：
根據使用量，取每 1ml 裂解液加入 10ul PMSF，使 PMSF 的最終濃度為 1mM。混勻備用（PMSF 現用現加）。
1、樣品前處理：
a)對于貼壁細胞：去除培養液，用 PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。按照 6 孔板每孔加入 150-250ul裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸，冰上放置裂解 5-10 分鐘。
b)對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照 6 孔板每孔細胞加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液，冰上放置裂解 5-10 分鐘。期間可以用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成 50-100 萬細胞/管，然后再裂解。
c)對于組織樣品：把組織剪切成細小的碎片。按照每 20 毫克組織加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量) 。 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
2、后處理：
充分裂解后，將裂解后的樣品 10000-14000g 離心3-5 分鐘，取上清，即可進行后續的 PAGE、Western 和免疫沉淀、免疫共沉淀等操作。
注意事項：
為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復凍融。可以適當分裝后使用。裂解樣品的所有步驟都需在冰上或 4℃進行。裂解時間可根據實驗要求進行優化處理。
非變性蛋白裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用 BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。由于含有較高濃度的 Triton X-100 等干擾物質，不能用 Bradford 法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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