SABC(兔IgG)-POD?kit-切片與免疫組化-蛋白與免疫
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SABC(兔IgG)-PODkit| 英文名稱 | SABC(Rabbit IgG)-POD Kit |
|---|---|
| 單位 | 盒 |
產(chǎn)品內(nèi)容：
封閉液（5% BSA） 10mL 3% H2O2 10mL Bio-羊抗兔IgG濃縮液 100μL SABC-POD濃縮液 100μL 稀釋液 30mL 20×DAB顯色液A 1mL 20×DAB顯色液B 1mL 保存： 如果長(zhǎng)時(shí)間不使用，請(qǐng)將所有試劑存放于-20℃，如經(jīng)常使用，可將封閉液、3% H2O2和20×DAB顯色液B存放于2-8℃以方便使用。 產(chǎn)品說(shuō)明： 本試劑盒適合于一抗為兔IgG的免疫組化實(shí)驗(yàn)，DAB顯色。 SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測(cè)而設(shè)計(jì)的，用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，同親和素一樣對(duì)生物素有極高的親和力，親和素是一個(gè)堿性蛋白質(zhì)（PI=10），經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點(diǎn)接近中性，對(duì)組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin-Biotin Complex，SABC大約可形成一百個(gè)左右的過(guò)氧化物酶和五十個(gè)左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物，大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。操作步驟:（以石蠟切片為例）
1、切片常規(guī)脫蠟至水(三次二甲苯，三次乙醇)。
2、3% H2O2室溫處理5-10分鐘以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗3次。
3、可選步聚：
a、熱修復(fù)抗原，將切片浸入0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（pH 7.2-7.6）洗滌1-2次。 b、酶消化，滴加消化液，37℃放置10分鐘，PBS（pH7.2-7.4）洗滌2-3次。c、跳過(guò)此步，直接進(jìn)入下一步。
4、滴加5% BSA封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體, 免洗。
5、用稀釋液將一抗按一定比例稀釋（稀釋后的一抗4℃可保存一周），也可另行購(gòu)買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗37℃ 孵育1小時(shí)左右或20℃ 孵育2小時(shí)左右，也可4℃過(guò)夜。PBS（pH7.2-7.4）洗滌3次，每次2分鐘（一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性染色強(qiáng)度不夠時(shí)，可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間；背景過(guò)高時(shí)，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間）。
6、根據(jù)用量，用稀釋液將Bio-羊抗兔IgG濃縮液按1:50-100稀釋成工作液(1mL稀釋液加入10-20μL Bio-羊抗小鼠IgG濃縮液混勻，此工作液4℃可保存一周)。 滴加Bio-羊抗兔IgG工作液， 20-37℃孵育30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗滌3次，每次2分鐘。
7、根據(jù)使用量，用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1mL稀釋液加入10μL SABC-POD濃縮液混勻，此工作液4℃可保存一周)。滴加SABC-POD工作液，20-37℃孵育30分鐘。PBS （pH7.2-7.4）洗滌4次，每次5分鐘。
8、DAB顯色：根據(jù)用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mL PBS加入50μL 20×DAB顯色液A，加入50μL 20×DAB顯色液B 。充分混勻后滴加到切片上，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。
9、蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。 對(duì)于細(xì)胞爬片，固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5% Triton X-100室溫孵育20分鐘，PBS漂洗兩次，3% H2O2處理15分鐘；PBS漂洗兩次，接上述第4步。對(duì)于冰凍切片，固定后，PBS漂洗兩次，接上述第二步。
注意事項(xiàng)： 如果染色背景過(guò)高，在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前，用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后DAB顯色。
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