TOP10感受態(tài)細(xì)胞-重組克隆表達(dá)-分子生物學(xué)
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| 英文名稱(chēng) | E.coli TOP10 Competent Cells |
|---|---|
| 儲(chǔ)存條件 | -70℃保存，運(yùn)輸為干冰包裝。自收貨之日起液氮保存至少一年，-70℃保存至少6個(gè)月。 |
| 外觀（性狀） | 干冰運(yùn)輸，單加10kg干冰費(fèi) |
| 單位 | 袋 |
本公司生產(chǎn)的TOP10感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌TOP10菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)108，-70℃保存六個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
基因型：F_ mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15△lacⅩ74 recA1 deoRaraD139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
特 點(diǎn)：一種用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重級(jí)缺陷的抑制型菌株。其中φ80 lacZΔM15基因的產(chǎn)物可與pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α-互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。該菌株適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。
操作方法：（以下各步驟均為無(wú)菌操作）
1，將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化，以下實(shí)驗(yàn)以100ul感受態(tài)細(xì)胞為例。
2、向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入需轉(zhuǎn)化的目的DNA，注意目的DNA的體積不要超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴放置30分鐘。
3、將離心管置于42℃水浴中60-90秒，然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中放置2-3分鐘，注意不要搖動(dòng)離心管。
4、向離心管中加入500ul無(wú)菌無(wú)抗的SOC或LB培養(yǎng)基，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。
5、取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布含相應(yīng)抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)。涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)調(diào)整，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取100ul左右的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300ul的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板。過(guò)多菌液可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。如果預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過(guò)離心后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少可以將剩下的菌液再涂布新的平板。
注意事項(xiàng)：
1、感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低。
2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止其它DNA或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來(lái)影響。
3、轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一。
4、轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。
5、為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到最低。
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