小鼠生殖工程學技術——12凍存、復蘇小鼠未受精卵
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回到小鼠生殖工程凍存及培養試劑
◆材料
１. 過量排卵處理的雌性小鼠２. 培養皿（corning 35mm X 10mm Cat.No.430588）３. 流動石蠟（NacalaiTesque Cat.No.26137-85）４. 自動移液器（GILSON PIPETMAN P-20）５. 黃色槍頭（BM器材 Cat.No.110-96R）６. mTHF７. 1%透明質酸酶溶液８. 胎牛血清（Gibco Fetal Bovine Serum(FBS) Cat.No.26140-087）９. 一次性過濾裝置（微孔孔徑：0.22μm Cat.No.SLGVJ13SL）10. 2.5mL注射器（泰爾茂Cat. No.SS-02SZ）11. 微管12. CO2培養箱（37°C 5% CO2 95% air）13. 可使用便捷玻璃化方法凍存和復蘇胚胎時使用的相同器材和培養基。
（用mHTF清洗復蘇后的未受精卵）
◆步驟
培養皿的準備
1. 制作采集卵子用的培養皿（1個200μL的mHTF滴液），靜置在培養箱內30分鐘。
２. 制作清洗卵子用的培養皿（4個80μL的mHTF滴液），靜置在培養箱內30分鐘。
３、 適量制作含2０％FBS的mHTF溶液并進行過濾滅菌，然后制作處理FBS用的培養皿（2個100μL含20%FBS的mHTF滴液），靜置在培養箱里30分鐘以上。
去除卵丘細胞
1. 從過量排卵的雌性小鼠里取出的卵子塊放進采集卵子用培養皿上200μL 的mHTF滴液里。（一個滴液可容納
5只小鼠的卵子塊）。
要點：從小鼠安樂死至采集輸卵管并將采集的卵子塊導入mHTF滴液的這一過程操作要在極短時間內完成（30秒內）
要點：1個人做實驗時，不要一次性讓多只小鼠安樂死，應該一只只地進行，并迅速采集卵子。
２. 用自動移液器（P-20）將20μL 的1%透明質酸酶溶液添加進含有卵子塊的200μL滴液里，靜置在37°C的培養箱里1分鐘。
３. 把去除卵丘細胞的卵子按順序轉移至80μL的mHTF滴液里（清洗卵子用的培養皿）。
要點：在37°C下清洗一分鐘后，即使不能完全去除卵丘細胞，清洗的過程中卵丘細胞也會漸漸剝離。
４. 在卵子清洗用培養皿的mHTF滴液里清洗去除卵丘細胞的卵子3次。
胎牛血清的處理（FBS）
１. 將未受精卵移至含20%FBS的mHTF的滴液（處理FBS用的培養皿）里，清洗2次，并培養10分鐘。 ＊FBS有利于凍存和復蘇過程中引起的未受精卵的透明帶硬化。
未受精卵的凍存
１. 去除卵丘細胞的未受精卵在含FBS的培養基里培養后，凍存和復蘇操作與胚胎的步驟相同。
（用mHTF清洗復蘇后的凍存精子）
用凍存、復蘇后的未受精卵子進行體外受精
1. 新鮮精子、冷藏運輸附睪尾部精子及用凍存精子進行體外受精的方法各有不同，請分別依照具體方法操作。
要點：使用的精子不同，體外受精用的受精培養基（CARD MEDIUM）的制備方法也不同。請仔細閱讀受精用培養基的操作說明書準備受精用培養皿。
參考文獻
【1】Nakagata N, Takeo T, Fukumoto K, Kondo T, Haruguchi Y, Takeshita Y, Nakamuta Y, Matsunaga H, Tsuchiyama S, Ishizuka Y, Araki K. 2013. Applications of cryopreserved unfertilized mouse oocytes for invitro fertilization.Cryobiology.Oct；67（2）：188-92.
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