實驗做到崩潰?這 10 個技巧讓做出發(fā)表級 WB 圖
01
快速處理您的組織
使用干凈的工具收獲和處理組織樣本。要去除可能影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的污染物，請在冰冷的中性 pH 緩沖液中短暫洗滌。洗滌后，在液氮中快速冷凍組織，以保留蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和特征，例如翻譯后修飾（PTM）。組織樣本可以保存在冰上，以便立即勻漿；然而，由于蛋白質(zhì)降解仍可能在 –20 °C 下發(fā)生，因此組織樣品應(yīng)保存在 –80 °C 以長期儲存。
02
仔細選擇裂解緩沖液
在選擇最佳裂解緩沖液以有效地從組織中提取蛋白質(zhì)時，請考慮 pH、離子強度以及去垢劑和變性劑類型等參數(shù)。RIPA 緩沖液是使用最廣泛的裂解緩沖液。在緩沖液選擇過程中，還應(yīng)考慮靶蛋白的細胞定位；例如，對于細胞質(zhì)蛋白，推薦使用 Tris-HCl 裂解緩沖液，而 RIPA 是提取核蛋白的首選。為了富集膜、胞質(zhì)或細胞核部分中的低豐度蛋白質(zhì)，可能需要組織分級分離。裂解緩沖液的量基于組織的大小/重量；考慮緩沖液與組織的比例對于確保有效裂解非常重要。首次建立從組織中提取蛋白質(zhì)的方案時，請嘗試使用不同的裂解緩沖液，以優(yōu)化組織類型和特定蛋白質(zhì)的條件。
03
選擇最佳破碎組織方法
由于與細胞相比，樣品結(jié)構(gòu)程度更高，因此組織需要更嚴(yán)格的破碎方法，如均質(zhì)化技術(shù)。為了進一步解離組織并剪切細胞 DNA，可能需要對樣品進行超聲處理。在此步驟中避免起泡很重要，因為它可能會降低您的回收量。確保已優(yōu)化機械破碎機的電源設(shè)置并使用預(yù)冷設(shè)備。
由于脂質(zhì)會影響蛋白質(zhì)免疫印跡的質(zhì)量，因此請確保去除樣品中的脂肪。從植物組織中提取蛋白質(zhì)特別具有挑戰(zhàn)性，因為它們富含蛋白酶并且含有高水平的代謝物，可以干擾蛋白質(zhì)提取（Wang 等人，2008）。提取過程必須針對您使用的特定植物組織進行優(yōu)化。已經(jīng)為植物組織開發(fā)了幾種蛋白質(zhì)提取方案，例如三氯乙酸/丙酮沉淀法或基于苯酚的提取（Wang 等人，2008）。
04
在樣品制備過程中抑制蛋白質(zhì)降解并保留翻譯后修飾
細胞膜的破壞釋放出可以降解蛋白質(zhì)的酶，盡管通過將樣品保持在低溫下來最小化其活性（Scopes 1994）。為了限制蛋白酶活性，可以在緩沖液中加入強變性劑，如尿素。然而，這些條件可能會影響某些蛋白質(zhì)的完整性；因此，裂解緩沖液常規(guī)補充蛋白酶抑制劑混合物。常見的蛋白酶抑制劑包括（PMSF），aprotinin，leupeptin，and pepstatin。
SUMO 化蛋白的鑒定可能特別具有挑戰(zhàn)性。這是由于去除 SUMO 偶聯(lián)物的異肽酶的活性，并且通常只有一小部分蛋白質(zhì)被 SUMO 化。因此，為了保存 SUMO 化，建議在裂解緩沖液中添加 isopeptidase inhibitors（Xiao 等人，2015）。泛素偶聯(lián)物的去除也很容易通過蛋白質(zhì)泛素水解酶（稱為去泛素酶（DUB））發(fā)生。因此，必須在細胞裂解緩沖液中添加 EDTA 或 EGTA 以及碘乙酰胺（IAA）或 N-乙基馬來酰亞胺（NEM）。IAA 和 NEM 通常以 5～10 mM 的濃度使用。然而，高達十倍的高濃度對于維持某些蛋白質(zhì)的泛素化至關(guān)重要，例如 IRAK1（Emmerich 和 Cohen 2015）。用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理也保留泛素化并阻止 26S 蛋白酶體的蛋白質(zhì)降解（Kisselev 等人，2012）。
05
在凝膠上樣前定量樣品
測定樣品濃度可確保凝膠的上樣量相等，并使您能夠比較處理樣品與未處理樣品中或?qū)嶒灂r間過程中蛋白質(zhì)水平的差異。Bradford assays，如 Bio-Rad 的 Quick Start Bradford Protein Assay，可用于每孔總蛋白質(zhì)上樣量的標(biāo)準(zhǔn)化。
06
尋找最好的凝膠
確定最適合目標(biāo)蛋白的凝膠的一個很好的起點: 根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量選擇聚丙烯酰胺百分比。例如，對于高分子量，選擇低百分比，對于低分子量，選擇高百分比。如果要檢測單個蛋白質(zhì)，請選擇非梯度凝膠。當(dāng)需要可視化一系列蛋白質(zhì)大小時，選擇梯度凝膠。非常高的電壓設(shè)置可能會導(dǎo)致凝膠「微笑」；為避免這種影響，請在冷藏室中電泳凝膠并使用預(yù)冷的電泳緩沖液。
07
驗證蛋白質(zhì)上樣量
根據(jù)蛋白質(zhì)的細胞定位選擇最佳上樣對照。細胞質(zhì)蛋白的常用上樣對照包括管家蛋白，例如 beta-actin 或 beta-tubulin；對于核蛋白，通常使用 histone H1 或 histone H3。近年來，許多研究報告了一些最常用的管家蛋白不適合當(dāng)做可靠的蛋白質(zhì)歸一化，強調(diào)生理和病理因素會影響它們的表達水平（Ferguson 等人，2005）。為了使加載歸一化有意義，必須在不同的實驗條件下保持恒定的水平；例如，加載控件的表達不應(yīng)受到處理的影響。即使在單個組織樣本中，beta-actin 表達也被證明不是均勻的（Eaton 等人，2013）。此功能突出了使用管家蛋白進行比較蛋白質(zhì)水平分析的問題。
管家蛋白的另一個常見問題是過載，這會導(dǎo)致檢測超出動態(tài)范圍。樣品的動態(tài)范圍取決于組織和蛋白質(zhì)測定方法。
Bio-Rad 的免染成像技術(shù)是 Bio-Rad 的免染成像技術(shù)，是用染料（如 Ponceau S）觀察蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)裝載可視化的一個很好的替代方案。該技術(shù)能夠?qū)⒚總€泳道中的條帶標(biāo)準(zhǔn)化為總蛋白質(zhì)（圖 1，Taylor 等人，2013）。該方法快速，并使用摻入凝膠中的轉(zhuǎn)利染料使蛋白質(zhì)在 UV 激發(fā)時發(fā)出熒光。與 Ponceau S 染色相比，免染技術(shù)提供了更大的線性范圍并減少了可變性（Rivero-Gutierrez 等人，2014 年）。此外，由于不需要對印跡進行染色，因此非常方便。
圖 1. 通過免染技術(shù)為總蛋白質(zhì)測量提供線性動態(tài)范圍。A，HeLa 細胞裂解物稀釋 80～2.5 μg 總蛋白。B，HeLa 細胞裂解物從 20～1 μg 總蛋白稀釋。
08
考慮膜類型
蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或 PVDF 膜上。PVDF 膜具有很高的機械強度，最適合需要膜剝離和重新剝離的情況。PVDF 具有疏水性，需要預(yù)浸泡在甲醇中。硝酸纖維素膜具有高信噪比，不需要甲醇預(yù)處理。需要注意的是，硝酸纖維素膜不能與含有 SDS 的轉(zhuǎn)印緩沖液一起使用。在選擇膜類型時，您可能還需要考慮其他參數(shù)，例如孔徑，這些參數(shù)會影響較大蛋白質(zhì)與較小蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。
09
降低內(nèi)源性免疫球
蛋白的高背景
在對組織裂解物進行蛋白質(zhì)印跡檢測時，來自內(nèi)源性 IgG 和非特異性二抗結(jié)合的信號可能會掩蓋對低豐度蛋白質(zhì)或特定分子量蛋白質(zhì)的檢測。對于 ~50 kD 和 ~25 kD 的蛋白質(zhì)尤其如此，它們可能會被組織樣品制備的變性和還原步驟中產(chǎn)生的 IgG 重鏈和輕鏈所掩蓋。
然后，IgG 鏈由與 IgG 重鏈和輕鏈結(jié)合的常規(guī)二抗常規(guī)檢測。當(dāng)使用組織樣本（例如胸腺或甲狀腺）時，這個問題最為明顯，這些樣本是免疫系統(tǒng)的一部分，因此含有大量的內(nèi)源性免疫球蛋白（圖 2）。
TidyBlot 蛋白質(zhì)印跡檢測試劑（STAR209P 和 STAR209PA）僅與用于蛋白質(zhì)印跡檢測的天然抗體結(jié)合，因此為生成干凈的組織裂解物印跡提供了良好的解決方案。
圖 2. 使用 Immun-Star 山羊抗小鼠（GAM）-HRP 抗體對不同的組織裂解物進行背景染色。
10
包括合適的組織對照
為了確保一抗的特異性，使用陽性和陰性組織對照非常重要。對于陽性對照，請使用文獻中指出表達高水平目標(biāo)蛋白的組織類型、過表達目標(biāo)蛋白標(biāo)記的小鼠組織或重組蛋白。推薦的陰性對照包括僅二抗對照（省略一抗孵育步驟）和已知不表達靶蛋白的組織樣品。包括特定的敲除樣本或組織特異性敲除小鼠模型，通過顯示未在某種組織類型中檢測到靶標(biāo)來確認抗體的特異性可能會有所幫助。
您還需要意識到，在疾病狀態(tài)下存在特定蛋白質(zhì)表達的定量差異;科學(xué)文獻中常見的一種現(xiàn)象。為了解釋這些差異，您可以包括來自健康和疾病組織的樣本來分析異常表達。
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