凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24)
Performance
覆蓋基因組所有位點，十分適用于二代測序和其他下游應用
REPLI-g Single Cell Kit擴增的DNA平均長度大于10 kb，并且覆蓋所有基因組位點。該產品已經過驗證，適用于二代測序、基于芯片技術的比較基因組雜交（aCGH）和real-time PCR應用等多種下游分析。使用該產品無需單獨進行PCR擴增，減少了手動操作，獲得的產物長度PCR方法更長（參見"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods"）。用擴增產物進行二代測序，獲得高品質結果。這表明該試劑盒的位點覆蓋率大，錯配率低，其擴增的DNA（甚至從單一細菌細胞中擴增的DNA）能夠與純化獲得的基因組DNA相媲美（參見"Comparable NGS results"）。另有研究對人類常染色體和X染色體上的多個標記物進行了分析，三個獨立的實驗均顯示：基因組的所有位點被成功擴增，沒有遺漏任何一個位點（參見"Complete genome coverage"）。
REPLI-g Single Cell Kit的表現優于其他供應商的試劑盒
其他供應商的試劑盒基于PCR技術進行全基因組擴增，獲得的產物片段較短，帶有PCR引物序列，可能影響下游應用。基于PCR的全基因組擴增容易出現錯誤，會導致堿基對突變、STR的減少或增多，使用低保真Taq DNA聚合酶會導致位點缺失。相反，REPLI-g Single Cell Kit能夠進行高度均一的全基因組擴增，位點偏差小。對四個試劑盒進行了檢測，其中兩個利用多重置換擴增技術（包括REPLI-g Single Cell Kit），另外兩個利用PCR技術。采用單一細胞擴增實驗方案對所有試劑盒進行序列位點檢測。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供應商的試劑盒都出現了位點的遺漏（參見"Unbiased DNA amplification from a single cell"）。
凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24)
Principle
REPLI-g Single Cell Kit含有REPLI-g sc Polymerase，這是一種優化的新型高保真Phi 29聚合酶。該試劑盒采用多重置換擴增技術擴增復雜的基因組DNA，溫和的堿孵育能夠避免DNA片段化，促進對所有位點的無偏差擴增。該試劑盒十分適用于分離的腫瘤細胞或細菌細胞等單一細胞，能夠擴增獲得高產量DNA（參見表1）。此外，該試劑盒還配有專用于鮮血或干血、新鮮或冷凍組織的實驗方案，可用于多種研究樣本。常規DNA產量可達40 µg，對模板的起始量要求低，因此進行后續遺傳分析時無需檢測DNA濃度。REPLI-g Single Cell Kit的擴增產物平均長度超過10 kb，且覆蓋所有位點，適合于多種應用，包括二代測序、基于芯片技術的比較基因組雜交、焦磷酸測序和real-time PCR分析（參見表2）。
表2. 下游應用和儀器| 應用 | 儀器 |
|---|
| 全基因組測序 | 二代測序平臺? |
| 外顯子組測序 |
| SNP基因分型芯片 | 芯片平臺? |
| Array CGH |
| qPCR/PCR技術 | Real-time PCR/PCR儀? |
| Sanger測序 | 毛細管測序儀? |
| 焦磷酸測序 | PyroMark (QIAGEN) |
? 多家供應商均有銷售
擴增原理
REPLI-g Single Cell Kit采用等溫基因組擴增技術，即多重置換擴增（MDA）。六聚體與變性DNA隨機結合，然后在等溫條件下，在優化的Phi 29聚合酶作用下，發生鏈置換合成反應。每個置換后的單鏈作為模板，與引物結合，可擴增獲得高產量DNA（參見"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology"）。Phi 29聚合酶為噬菌體衍生酶，具有3'→5'引物外切酶活性（校正活性），其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在優化的REPLI-g Single Cell緩沖液體系中，能夠輕松的打開發卡結構等二級結構，因此可促進擴增時聚合酶正常工作。可擴增獲得長達100 kb的DNA片段（參見"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase"）。
細胞裂解和DNA的堿變性
基因組DNA在用于酶促擴增反應前必須經過變性，而這一變性過程通常使用高溫或高pH值（強堿）孵育。REPLI-g Single Cell Kit采用溫和的堿孵育，在細胞裂解、DNA變性的同時，確保DNA片段化程度小，不產生堿基突變。因此擴增獲得的DNA完整度高，產物長度長，覆蓋位點多（參見"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation"）。
高效去除可檢測到的DNA污染
REPLI-g Single Cell Kit中的所有組分都經過了dute的去污染流程，避免擴增產物被污染。在標準化流程中，對緩沖液和試劑進行紫外線照射，確保其不會污染DNA（參見"Innovative decontamination procedure"）。紫外線照射后，對試劑盒的所有組分進行嚴格的質量控制，確保其性能。
Procedure
簡單的單管操作
REPLI-g Single Cell Kit可對單一細胞或有限的樣本進行簡便、可靠、準確的全基因組擴增。反應體系構建十分便利、可靠，僅需15分鐘左右的手動操作（參見"REPLI-g Single Cell Kit procedure"）。專用的緩沖液和試劑可對單一細胞、有限的組織材料、或純化的DNA進行擴增，產量高、位點覆蓋率大（參見表3）。REPLI-g技術擴增獲得的DNA可在–20°C長期儲存（參見"Consistent long-term stability"）。請參見表4，了解REPLI-g產品線的更多信息。
表3. REPLI-g Single Cell Kit的成分| 試劑盒成分 | 優勢 |
|---|
| REPLI-g sc Polymerase | 最長可達70 kb的長片段 |
| 保真性是Taq聚合酶的1000倍 |
| 覆蓋所有位點 |
| 均一擴增所有位點 |
| REPLI-g sc Reaction Buffer? | 對所有位點進行無偏差的擴增 |
| Buffer DLB （裂解和變性） | 高效擴增 |
| 不損傷DNA |
| 紫外線照射去除污染 | 減少可檢測到的殘留DNA污染 |
? 含有鹽、引物和dNTP
表4. 多種REPLI-g Kits的規格 | REPLI-g Single Cell | REPLI-g Mini | REPLI-g UltraFast Mini | REPLI-g Midi | REPLI-g Screening | REPLI-g FFPE | REPLI-g Mitochondrial DNA |
|---|
| 起始材料 | 單一細胞、gDNA | 純化的基因組DNA、血液、細胞 | 純化的基因組DNA、血液、細胞 | FFPE組織、FFPE組織中純化的基因組DNA | 純化的基因組DNA |
| 另外提供其他起始材料的實驗方案 |
| 起始量 | 單一細胞、2–1000各細胞、組織、純化的gDNA （1–10 ng） | >10 ng gDNA、0.5 µl血液或細胞（>600個細胞/µl） | >10 ng gDNA、0.5 µl血液或細胞（>600個細胞/µl） | 組織切片（直徑1 cm，厚度10–40 µm）；>100 ng gDNA | >1 ng純化的gDNA |
| 產量（µg/反應） | 40 | 10 | 7–10 | 40 | 8 | 標準產量：≤10; 高產量：≤40 | 3–5 |
| 反應時間 | 8–16小時 | 10–16 小時 | 1.5小時 | 8–16小時 | 12–16小時 | 標準產量：4小時；高產量：10小時 | 8小時 |
| 手動操作時間 | 15分鐘 | 15分鐘 | 15分鐘 | 15分鐘 | 15分鐘 | 40分鐘 | 15分鐘 |
| 規格 | 反應管 | 反應管 | 反應管 | 反應管 | 孔板 | | |
Applications
使用REPLI-g Single Cell Kit擴增獲得的DNA可用于多種下游應用，包括：
二代測序
采用TaqMan引物/探針對進行的SNP基因分型
基于qPCR和PCR的突變檢測
STR/微衛星分析
Sanger測序
焦磷酸測序
aCGH等芯片技術
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