Lipi-Red試劑貨號：LD03
脂滴檢測（紅色）
Lipi-Red
商品信息
儲存條件：在冷暗處保存
運輸條件：室溫
特點：
●高特異性脂滴定位
● 可進行組織脂滴成像
● 多種顏色可供選擇
選擇規格：
100nmol
湊單關聯產品TOP5
NO.1.Cell Counting Kit-8 細胞增殖毒性檢測
NO.2.FerroOrange細胞亞鐵離子檢測
NO.3. Glucose Assay Kit-WST葡萄糖檢測
NO.4. Liperfluo細胞脂質過氧化物檢測
NO.5. MitoPeDPP線粒體內脂質過氧化物檢測
概述
Lipi系列探針是高脂肪親脂性小分子探針，其在疏水環境例如脂滴中發出強熒光。活細胞和固定細胞中的脂滴都可以使用本試劑清楚地觀察。
原理
脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪組成，主要包括甘油三酯和膽固醇酯，其外層被一層單層磷脂分子包裹。而且脂滴不僅在脂肪細胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明，以前認為脂滴僅是一個簡單的脂質儲存器，但最近的研究表明其在調節脂質代謝1)，自噬2)和細胞衰老3)等方面都起著重要作用，因此需要進一步詳細地研究脂滴形成·成長·融合·分解的機制。Lipi系列探針是高脂肪親油性小分子探針，可在疏水環境例如脂滴中發出強熒光。Lipi探針染色后，無須洗滌即可觀察到脂滴。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂滴的染色例
在活細胞狀態下，用油酸誘導HeLa細胞后，用不同顏色的Lipi系列熒光探針檢測
檢測條件：
* Lipi-Blue ：Ex：405 nm, Em：450–500 nm
* Lipi-Green：Ex：488 nm, Em：500–550 nm
* Lipi-Red：Ex：561 nm, Em：565–650 nm
* Lipi-Deep Red：Ex：640 nm, Em：650–700 nm
染色條件：
在HeLa細胞培養基中加入200 μmol/l油酸，過夜培養后，用PBS清洗細胞，并分別加入不同顏色的Lipi探針(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red： 1 μmol/l) 染色15 min后觀察。
如何制備油酸溶液
請參考Q&A“油酸溶液的制備和加入細胞的方法”。
與競爭品比較
Lipi系列熒光探針大幅度地改善了現有脂滴染色試劑存在的問題 (如選擇性，濾波器的適應性，熒光滯留性)。而且 Lipi系列熒光探針也適用于多重染色實驗，可選顏色更多。
| 同仁化學試劑 |
其他品牌（T公司） |
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Lipi-Blue |
Lipi-Green |
Lipi-Red |
Lipi-Deep Red |
Oil Red O
(比色) |
Nile Red |
試劑B |
| 活細胞染色 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
× |
〇 |
〇 |
| 固定細胞染色 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
| 對脂肪滴的選擇性
(低背景) |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
× |
× |
△ |
| 與其他試劑的共染色*1 |
〇 |
〇 |
〇*2 |
〇 |
n.d. |
×*3 |
〇 |
| 活細胞內的滯留性(24h) |
〇 |
〇 |
× |
× |
n.d. |
× |
× |
*1. 關于共染色時推薦的熒光濾光片，您可以參考網頁下方Q&A“共染時推薦的熒光濾光片”。
*2. 與綠色熒光共染色時，推薦使用550 nm以下的綠色熒光濾光片。
*3. 用GFP的濾光片(500~540 nm)時會串色。
產品特點
特點1：與抗體檢測方法高度相關
用4％PFA固定HepG2細胞后，用1 μmol/l Lipi-Red 染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗體熒光標記，免疫染色，該抗體可以特異性標記脂滴膜上的蛋白質 (Adipophilin; ADFP)。實驗證明Lipi-Red 與脂滴上蛋白質ADFP的定位高度相關。
<檢測條件>
Lipi-Red：Ex: 405 nm / Em: 450-500 nm，
抗ADFP抗體(Alexa Fluor 647)：Ex: 640 nm / Em: 650-700 nm
特點2：高特異性定位脂滴
在HeLa活細胞中加入油酸，并用1μmol/L Lipi-Red和100 nmol/l Nile Red（T公司）染色。該結果顯示Nile Red會染上脂滴以外的其它細胞質。
<檢測條件>
Lipi-Red：Ex: 561 nm / Em: 565 – 650 nm
Nile Red：Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
特點3：光譜范圍更窄，不易串色(Lipi-Red vs Nile Red)
在單通道情況下，Lipi Red和Nile Red（T公司）染色HepG2會用G激發觀察紅色熒光。而在多重染色情況下，可能會用B激發觀察綠色熒光，此時Nile Red會出現串色現象。
在用Lipi-Red染色的細胞中，確認了由于G激發引起的紅色熒光，并且沒有確認由于B激發引起的綠色熒光泄漏。 另一方面，在用尼羅紅染色的細胞中，觀察到由于G激發引起的紅色熒光，但是由于B激發而觀察到綠色熒光的泄漏。
特點4：熒光在細胞中的滯留時間長
分別用Lipi系列、Nile Red和市售的試劑B染色HepG2細胞，觀察在培養30 min和24 h的熒光圖像。
實驗例
用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪細胞，可以清楚地檢測出脂肪細胞中的脂質。
<脂肪細胞染色實驗例>
(1)將3T3-L1細胞(1.5×104cells/孔)接種在μ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO2培養箱內培養。
(2)按照常規方法誘導分化為脂肪細胞。
(3) 去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 無酚紅）洗滌兩次。
(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，無酚紅）制備的每種染料的工作溶液，并在37℃下培養24 h。
(5)用熒光顯微鏡觀察。
※試劑濃度：各2.5 μmol/l
實驗例2：脂肪組織的脂滴成像
用4%PFA固定小鼠肝臟脂肪組織(冰凍切片)后用Lipi系列染色，比較幼鼠(6周齡)和老年小鼠(31周齡)的脂滴成像圖像，發現肝臟脂肪組織中的脂滴量有很大差異。
<組織樣品的染色實驗例>
(1)向小鼠肝臟脂肪組織(冰凍切片)中加入4%PFA(PBS)，在室溫下靜置5 min。
(2)用PBS清洗后，加入各濃度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下靜置24 h。
(3)用PBS清洗后，用落射型熒光顯微鏡進行熒光觀察。
※工作液濃度：2.5 μmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 μmol/l(Lipi-Red)
實驗例3：使用細胞成像儀進行定量分析
將油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制劑）分別加入到HepG2細胞中，并比較脂滴的變化。在分析中，我們使用共聚焦定量細胞成像儀(橫河電機株式會社 CQ1)獲得每個細胞脂滴數量和面積的數據。
脂肪滴和細胞核的成像
使用共聚焦定量細胞成像儀在617/73 nm處拍攝脂滴圖像，在447/60 nm處拍攝細胞核圖像，在分析軟體CellPathfinder中識別單個脂滴和細胞核，并計算其數量和面積。
橫河電機CQ1拍攝條件
使用板：96 well plate，物鏡：20倍
激發波長 ：405 nm (DAPI)：)：藍色、561 nm (Lipi-Red)： 紅色
紫框線：細胞核、黃框線：脂滴
脂滴數量及面積的分析
根據細胞核和脂滴的檢測數據，每個細胞的脂滴的數量和面積如圖所示。結果，加入油酸的脂滴增加了7-13倍，而加入Triacsin C抑制了脂滴的形成，脂滴數量減少到Control組的60%。
細胞處理及脂滴染色條件
將HepG2細胞(1×103cells)接種到96孔板中過夜培養。除去培養上清液后，加入未處理（僅含FBS的DMEM培養基）、油酸（含200 μmol/l油酸和FBS的DMEM培養基）或Triacsin C（含5 μmol/l Triacsin C和FBS的DMEM培養基）過夜培養。之后用PBS 清洗2次，用4%的PFA在室溫下固定5 min后，用PBS 清洗2次。最后，加入1 μmol/l Lipi-Red working solution 在室溫、避光下染色2 h后，用共聚焦定量細胞成像儀進行定量分析。
Lipi系列熒光圖譜
脂肪滴產品種類的檢測方法
|
產品名稱 |
規格 |
貨號 |
| 成像(成像)
脂滴熒光探針 |
Lipi-Blue |
10 nmol |
LD01 |
| Lipi-Green |
10 nmol |
LD02 |
| Lipi-Red |
100 nmol |
LD03 |
| Lipi-Deep Red |
10 nmol |
LD04 |
| 定量（熒光酶標儀，FCM）
脂滴熒光檢測試劑盒 |
Lipid Droplet Assay Kit – Blue |
1 set |
LD05 |
| Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red |
1 set |
LD06 |
常見問題Q&A
| Q1：油酸溶液的制備和加入細胞的方法 |
| A1：我們按照以下步驟制備和使用油酸溶液。
<油酸儲存溶液>
必要的試劑
·BSA(牛血清白蛋白)
·油酸
·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0)
制備步驟
1)在0.1 mol/l Tris-HCl（pH8.0）中加入BSA并溶解（BSA：濃度0.14 g/ml）。
2)在容器(一次性的離心管)中加入油酸后，加入步驟1）得到的BSA溶液，使用渦旋振蕩器進行混合(油酸濃度：4 mmol/l)。*1
3)用孔徑為0.22 μm的注射式過濾器(PTFE)過濾步驟2)的混合溶液。
4)每次使用后冷藏保存。*2
* 1 油酸和BSA溶液混合可能導致液體混濁，繼續搖動讓油酸和BSA形成復合物使混濁會消失。
* 2 將所需量的油酸儲備溶液加入到實驗使用的培養基中，用于將油酸加入到細胞中。
<加入細胞的方法>
1)將細胞在37℃ 5%CO2培養箱內培養24 h。
2)用加入了油酸儲備溶液的培養基(油酸的終濃度200 μmol/L)替換，再培養24 h。
3)然后按照說明書對脂滴進行熒光染色觀察。 |
| Q2：共染時推薦的熒光濾光片。 |
|
|
| Q3：檢測不到熒光信號的應對方法是什么？ |
| Q4如果沒有檢測到熒光信號，可能會有幾個因素。
請確認以下內容，并根據情況考慮優化條件。
1.激發·發射波長與染料的熒光特性不一致。
確認說明書上的熒光圖譜和您儀器的激發和發射波長是否匹配。
2.染色條件不是最合適的。
[試劑濃度]
確認工作液的濃度是否在以下范圍內。
Lipi-Blue，Lipi-Green：0.1-0.5μmol/l
Lipi-Red：1-5μmol/l
*如果在上述條件下仍未檢測到熒光信號，請提高染色濃度。
Lipi-Blue，Lipi-Green：1-2μmol/l
Lipi-Red：10-20μmol/l
[染色時間]
-一般是30min，如沒有熒光信號可以延長染色時間至1-2 h。
3.固定條件不適合。
根據細胞種類不同，染色前后的固定操作可能會導致無法染色或靈敏度減弱。
在這種情況下，“請參考Q&A：是否可以對固定細胞進行染色？。
4.脂滴小，難以確認。
根據細胞的不同，可能會有脂滴很小難以確認的情況。
這種情況下，我們建議在高倍率的顯微鏡下確認，或用油酸處理細胞作為陽性對照進行評估。 |
| Q4：是否可以對固定細胞進行染色? |
| A4：可以染色，固定細胞的染色步驟有以下注意事項：
※請用多聚甲醛 (PFA) 固定細胞，不建議用甲醇等醇類固定細胞，因為可能會影響脂滴的結構。
※部分細胞種類染色后，如果在固定細胞過程中出現無染色或染色強度不夠的情況，需要摸索最佳固定條件。
○細胞染色后固定實驗例 (以HepG2細胞為例)
1. 將HepG2細胞接種在μ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培養箱中過夜培養。
2. 去除培養基，用PBS清洗2次。
3. 在細胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培養箱中培養15 min。
4. 去除上清液，用PBS清洗2次。
5. 加入4% PFA (在PBS中)，在室溫固定5 min。
6. 去除上清液，用PBS清洗后，在熒光顯微鏡下觀察。
○細胞染色前固定實驗例 (以HeLa細胞為例)
1. 將HeLa細胞接種在μ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培養箱中過夜培養。
2. 去除培養基，用PBS清洗2次。
3. 加入4% PFA (在PBS中)，在室溫固定5 min。
4. 去除上清液，用PBS清洗2次。
5. 在細胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培養箱中培養30 min。
6. 去除上清液，用PBS清洗后，在熒光顯微鏡下觀察。 |
| Q5：綠色濾光片會有熒光泄露嗎。 |
| A5：與市場上的Nile Red相比，Lipi-Red的泄漏較少，但根據濾光片的種類和激發光的強度，熒光又可能會泄漏到綠色濾光片中。在觀察帶有不同染料的綠色濾光片時，請注意以下幾點。
·選擇550 nm以下綠色熒光濾光片。
·一邊調整激發光的強度，一邊檢測熒光。 |
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