Fluo 3-AM試劑貨號：F023
1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester
CAS號：121714-22-5
商品信息
儲存條件：-20度保存，避光
運輸條件：室溫
分子式：
C51H50Cl2N2O23
分子量：
1129.85
特點：
●激發波長480-500 nm，發射波長523-530 nm
●激光共聚焦，流式細胞儀均可檢測
選擇規格：
1mg
產品性狀
規格
性狀： 本產品為紅色粉末，使用時將固體溶解于無水DMSO中
純度（HPLC）: 98%以上
熒光光譜圖： 符合實驗要求
NMR光譜圖： 符合實驗要求
處理條件
保存方法 ： 避光冷凍
產品概述
Fluo 3-AM是一種檢測細胞內鈣離子的熒光探針。Fluo 3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與鈣離子Ca2+結合后熒光會增加60至80倍，是目前最常用的一種鈣離子熒光探針。激光共聚焦熒光顯微鏡具有氬激光器，所以Fluo 3可被廣泛使用于這種顯微鏡上。這種熒光信號發出來的長波也便于減小對樣品細胞的光損傷。Fluo 3也可用來檢測紫外光照射下可裂解的螯合鈣或其它形式的鈣。Fluo 3-AM是Fluo 3的一種乙酰甲酯衍生物，通過培養，能夠輕易進入細胞中。
原理
Fluo 3-AM (鈣離子熒光探針) 需用無水DMSO (anhydrous DMSO)配制。Fluo 3-AM是一種可以穿透細胞膜的熒光染料。Fluo 3-AM進入細胞后可以被細胞內的酯酶剪切形成Fluo 3，從而被滯留在細胞內。Fluo 3可以和鈣離子結合，結合鈣離子后可以產生較強的熒光，最大激發波長為506nm，最大發射波長為526nm
激發發射波長
E x ：480-500 nm
E m ：525-530 nm
操作步驟
1、用 HBSS 溶液稀釋 1-5 mmol/l 的 Fluo 3-AM 母液，配制成 1-5 μmol/l的 Fluo 3-AM 工作液
（此濃度僅供參考，請根據具體實驗要求自行調整）。
例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 濃度為 5 μmol/l工作液的方法：用 1 ml HBSS 溶液稀釋 5 μl母液
即可。Fluo 3-AM 工作液需要即配即用，請勿反復凍存。如果Fluo 3-AM進入細胞的效果不好，
可使用Pluronic?F-127，后者可以防止Fluo 3-AM在緩沖液里聚合并能促進其進入細胞。
*Pluronic?F-127先用DMSO溶解至濃度為 20%（W/V），然后根據實驗需要直接加入Fluo 3-AM工作液
中至終濃度為 0.04-0.05%（此濃度僅供參考，請根據具體實驗要求自行調整）。
2、取出預培養的細胞，除去培養基，用 HBSS 溶液洗滌細胞 3 次。
如果使用含血清的培養基，血清中的酯酶會分解 AM 體，從而降低 Fluo 3-AM 進入細胞的效果。
另外含有酚紅的培養基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養基殘留。
3、加入 Fluo 3-AM 工作液，溶液量以覆蓋細胞為準。
4、37℃細胞培養箱孵育10-60分鐘，除去Fluo 3-AM工作液。關于孵育的時間，如果首次做實驗不能定，
建議先孵育 30 分鐘，看熒光效果：如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，
適當延長時間。
5、用 HBSS 溶液洗滌細胞 3 次以充分去除殘留的 Fluo 3-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆蓋細胞。
6、37℃培養箱孵育約 20-30 分鐘，以確保 AM 體在細胞內的完全去酯化作用。
如果細胞內酯酶活性較低，建議嚴格按照此操作進行；酯酶活性高的細胞實驗，可以忽略此步。
7、用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測細胞，激發波長 480-500 nm，發射波長 525-530 nm。
注意事項
1、試劑容易吸潮，從冰箱取出后，請確認在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑極其微量，
開封前，請輕彈管壁幾次，以保證粉末落入管底。
2、第一次使用時, 建議母液即配即用。試劑溶解后盡可能在短時間內使用，以保證實驗效果。
3、溶解液DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導致AM體水解，使熒光染料無法進入細胞，影響實驗效果。
4、母液遇水極易分解，如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成5 μl/管，用封口膜封口，并用
鋁箔紙包裹，放在一個密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。
5、建議您在正式實驗前先摸索一下細胞量、鈣離子熒光探針終濃度、培養時間等，找到最佳實驗條件。
實驗例
加載了Fluo 3的新鮮分離的大鼠肝臟細胞PE刺激后出現規則胞漿鈣振蕩。
上圖為細胞明場圖和不同時間點(min)的比例成像，
下圖為影響Fluo 3熒光強度隨時間的變化。
成像系統：Photon Technology International Inc.，
顯微鏡Nikon TE2000U，CCD相機QuantEM512S,軟件ERP。
(北京師范大學細胞生物學研究所 崔宗杰教授 提供照片)
數據分析
計算公式：
[Ca2+]i = Kd×(F-Fmin) / (Fmax-F)
[Ca2+]i ：細胞內Ca2+濃度
Kd：解離常數
F ：熒光強度
Fmin：Ca2+為零狀態下測得的熒光比值
Fmax：Ca2+為飽和狀態下測得的熒光比值
Q&A
| Q1:細胞內檢測鈣離子的試劑種類都有什么，選擇什么樣的比較好呢？ |
| A1: 根據檢測儀器和檢測波長有很多的選擇，產品后面標有AM的試劑是可以通過細胞膜的
有很多種相似的試劑，其特點如下：
【Fura 2】
?雙波長激發
激發(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、發射：λem=500 nm
?解離常數：224 nmol/L
?因為是熒光強度的比值、可以有效的減小誤差
=>細胞內Ca濃度計算。
?該試劑被使用的最多
?必須要更換過濾片、會耽誤一些時間。
【Fluo 3】
?單波長激發
激發：λex=508 nm、發射：λem=527 nm
?解離常數：400 nmol/L
?因為激發光在長波段，所以對細胞的損傷比較小
（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發裝置。
?不適合切片中鈣離子的檢測
?【Fluo 4】
?單波長激發
?激發：λex=495 nm、發射：λem=518 nm
?解離常數：360 nmol/L
?與Fluo3相比對熒光強度更高。
?因為激發光在長波段，所以對細胞的損傷比較小
?（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發裝置。 ?與Fluo3相比對細胞的毒性低
?【Indo 1】
?單波長激發
?激發：λex= 330 nm、發射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)
?解離常數：250 nmol/L
?由于不需要更換濾光片，可以很快地檢測細胞內鈣離子濃度變化以及像心肌細胞運動中鈣離子的變化
?（需要兩臺檢測儀器）
?【Rhod 2】
?單波長激發
?激發：λex=553 nm、發射：λem=576 nm
?解離常數：1.0 μmol/L
?因為激發光在長波段，所以對細胞的損傷比較小
?（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發裝置。
?【Quin 2】
?單波長激發
?激發：λex=339 nm、發射：λem=492 nm
?解離常數：110 nmol/L
?最早開發的產品 |
?
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