Cellstain- CFSE試劑貨號：C375
5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate
CAS號：150347-59-4
商品信息
儲存條件：-20度保存
運輸條件：室溫
分子式：
C29H19NO11
分子量：
557.46
特點：
● 可用于細胞增殖檢測
● 長效熒光染色，最長三周可見
● 可用于流式細胞儀檢測
選擇規格：
1mg
湊單關聯產品TOP5
NO.1. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測
NO.2. Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit細胞凋亡檢測
NO.3. Calcein-AM細胞質染色
NO.4. Cell Viability Assay Kit細胞增殖/毒性檢測
NO.5. FerroOrange細胞亞鐵離子檢測
規格性狀
規格
特性：該產物為無色至微黃色固體，可溶于二甲基亞砜和乙腈。
可溶于二甲基亞砜：試驗成功
NMR光譜：試驗成功
產品概述
熒光染料 CFSE(CFDA-SE)，是一種可對活細胞進行熒光標記的新型染料，可以標記活體細胞。其基本原理如下：CFSE 是一種帶有琥珀酰亞胺(NHS)的熒光染料，可以結合細胞內的蛋白質。CFSE在結構上將酚羥基部位改造成 AM 體，所以自身不發熒光，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細胞膜，在活細胞內與胞內蛋白共價結合，進入細胞內的 CFSE 的 AM 部位能被細胞內酯酶水解發出綠色熒光。CFSE 的琥珀酰亞胺(NHS)和細胞內蛋白質的氨基部位結合，固定在細胞內，不會漏出細胞外。CFSE 進入細胞后定位于細胞膜、細胞質和細胞核，在細胞核的熒光最強。
在細胞分裂增殖過程中，CFSE 的熒光強度會隨著細胞的分裂而逐級遞減，標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半，根據這一特性，它可被用于檢測細胞增殖，細胞周期的估算及細胞分裂等方面。另外，CFSE 標記的細胞用于體內觀察可以長達數周之久，它常被用來做活體細胞檢測實驗和用熒光電鏡觀察細胞長期活動的實驗。有報道證實 CFSE 毒性小，不影響細胞的增殖能力。此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患。可以更快速，更準確和更安全地得到想要的實驗數據。
原理
熒光特性
熒光波長：λex=496 nm, λem=516 nm
操作說明
＊建議您在正式實驗前先摸索一下細胞量、CFSE的終濃度、培養時間等，找到最佳實驗條件。
配制試劑：
1、從冰箱中取出CFSE試劑，放至室溫后再打開。盛放CFSE的管子開蓋前請輕彈管壁幾次，讓粉末充分落入管底，必要時可采用離心的方法。
2、取0.9 ml DMSOa)加到CFSE管中溶解，配制成2 mM的CFSE母液b)（加入DMSO后請先蓋上蓋子，反復顛倒把蓋子和管壁上的試劑洗到底部，并用移液器反復吹打使溶解完全）。
3、用PBS(-)或適當的緩沖液將其稀釋成100 μM或其它濃度（如果采用載玻片觀察法，建議濃度為20 μM的工作液c))。
a) DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導致AM體水解，使熒光染料無法進入細胞，影響實驗效果。
b) 由于CFSE母液遇水極易分解，所以建議分裝保存，例如分裝成5 μl/管。
方法：分裝后用封口膜密封管口，再用錫箔紙包裹，最后和干燥劑一起用塑料袋密封，≦-20℃冷凍保存。
c) CFSE工作液應現配現用，因為CFSE吸水會分解，影響染色效果。
* PBS(-)：不含鈣和鎂離子的PBS。
細胞染色(僅供參考)：
例1 培養板觀察法
1、準備細胞懸液，用PBS(-)等合適的培養基a)調整細胞濃度至約107個／ml。
2、取1ml細胞懸液至試管中，加入適量CFSE工作液，輕輕攪拌混勻（建議CFSE的終濃度參考相關論文或做個預實驗：分別設定終濃度為0.5,1,2,5,10,20 μM…,以確定最佳染色濃度b)）。
3、在37℃培養箱中培養15-30分鐘。
4、離心后去上清，加入2 ml PBS溶液，再離心后去上清，重復此操作一次。
5、加入合適的培養基制成細胞懸液。
6、取500 μl的細胞懸液加在培養孔中，用熒光顯微鏡觀察，看到熒光后，根據自己實驗的要求調整細胞數量c)進行實驗。
例2載玻片觀察法
1、準備1 ml細胞懸液，用PBS(-)等合適的培養基a)調整細胞濃度至約107個／ml。
2、取30 μl細胞懸液至試管中，加入10 μl濃度為20 μM的CFSE工作液（終濃度為5μM），輕輕攪拌混勻b)。
3、在37℃培養箱中培養15-30分鐘。
4、滴10 μl的細胞懸液在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察，看到熒光后，根據自己實驗的要求調整細胞數量C)進行實驗。
＊如果背景高的話，第3步之后需要洗去多余的CFSE：
離心后去上清，加入90 μl PBS溶液，再離心后去上清，重復此操作一次。
a)盡可能用不含血清的培養基，血清中的酶和蛋白質會分解CFSE，可能會影響染色效果。
b)如果熒光強度弱，可以適當提高CFSE的終濃度。如果細胞毒性大或背景太高，可以適當降低CFSE的終濃度，請摸索條件找到最佳濃度。
c)根據不同的實驗目的和要求，采用稀釋的方法調整細胞數量。
文獻
1) M. Bronner-Fraser, “Alterations in Neural Crest Migration by a Monoclonal Antibody That Affects Cell Adhesion”,J. Cell Biol.,1985,101, 610.
2) A. Nose and M. Takeichi, “A Novel Cadherin Cell Adhesion Molecule:Its Expression Patterns Associated WithImplantation and Organogenesis of Mouse Embryos”,J. Cell Biol.,1986,103, 2649.
3) S. A. Weston and C. R. Parish, “New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy”,J. Immunol. Methods,1990,133, 87.
4) C. K. Raymond, P. J. O’hara, G. Eichinger, J. H. Rothman and T. H. Stevens, “Molecular Analysis of the Yeast VPS3 Gene and the Role of Its Product in Vacuolar Protein Sorting and Vacuolar Segregation during the Cell Cycle”,J. Cell Biol.,1990,111, 877.
5) G. Radcliff, R. Waite, J. Lefevre, M. D. Poulik and D. M. Callewaert, “Quantification of Effector/Target Conjugation Involving Natural Killer(NK) or Lymphokine Activated Killer(LAK) Cells by Two-color Flow Cytometry”,J. Immunol. Methods,1991,139, 281.
6) S. A. Weston and C. R. Parish, “Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes”,Cytometry,1992,13, 739.
7) L. S. D. Clerck, C. H. Bridts, A. M. Mertens, M. M. Moens and W. J. Stevens, “Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function”,J. Immunol. Methods,1994,172, 115.
常見問題Q&A
| Q1請告訴我如何使用CFSE。 |
| A1：參考文獻[1]中的描述如下所示。
殺死7-10周大的CBA / H小鼠，去除脾臟（或其他目標器官），然后浸入F15培養基（1％FCS）中。
然后，通過金屬網獲得細胞懸液，并通過離心除去紅細胞，死細胞等。
將純化的淋巴細胞懸浮在pH 7.0的PBS中至50,000,000細胞/ mL。
加入5.0μM濃度的CFSE，并在37°C下標記15分鐘。懸浮在冰冷卻的F15培養基（1％FCS）中并離心
用（350g，5分鐘，20℃）洗滌兩次。懸浮在F15培養基中。
靜脈注射到CBA / H小鼠中。一定時間后，殺死鼠標并去除脾臟（或其他目標器官）。
切除淋巴細胞并分離并通過流式細胞儀分析。
參考文獻[2]是關于鈣黃綠素-AM的，但也通過與[1]相同的步驟將其與CFSE進行了比較。
【參考文獻】
1. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, J. Immunol. Methods, 133, 87 (1990).
2. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, Cytometry, 13, 739 (1992). |
| Q2：細胞染料的激發波長和發射波長是多少。 |
| A2： |
| Q3:細胞染色試劑Cellstain的哪些活細胞染色染料可以在細胞中長時間停留？ |
| A3: “就細胞內保留而言，“ CFSE”可以在細胞中停留最長時間。盡管熒光強度降低，但是已經證實細胞中存在熒光染料達8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”觀察到熒光達3天。也有報道稱“鈣蛋白-AM”在6小時內在細胞中保留了90％”
?S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990)
?H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)”
但是，“鈣調蛋白-AM”和“ BCECF-AM”對細胞毒活性沒有影響。
?L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994)
還要注意的一點是，原始的基本骨架是熒光素，因此由于激發光而褪色由于容易發生，因此可能難以通過長期激發來觀察熒光。
（盡管最好使用防褪色劑等） |
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