一、普通PCR技術(shù)
KARY MULLIS （1944.12.28-2019.8.7）
Kary Mullis于1983年發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（polymerase chain reaction ，PCR），據(jù)說是載著女友開車的時候，忽然靈光一閃，想到了PCR原理（論開車的好處）。Kary Mullis于1993 年獲諾貝爾化學(xué)獎。《紐約時報》如此評價：" 具有高度原創(chuàng)性和重大意義，幾乎將生物學(xué)分為 PCR 前和 PCR 后兩個時代。
PCR的原理：在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。
普通PCR的優(yōu)點
經(jīng)典方法，國際和國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)齊全
儀器試劑成本較低
PCR產(chǎn)物可以回收后做其他分子生物學(xué)實驗
普通PCR的缺點
容易污染
操作繁瑣
只能定性分析
敏感性中等
存在非特異性擴(kuò)增，當(dāng)非特異條帶與目的條帶大小一樣時無法區(qū)分
基于毛細(xì)管電泳的PCR
針對普通PCR的缺點，一些廠家推出了基于毛細(xì)管電泳原理的儀器，將PCR擴(kuò)增后電泳的步驟在毛細(xì)管中完成，靈敏度更高，可以區(qū)分幾個堿基的差異并且通過MAERKER可以計算出擴(kuò)增產(chǎn)物的含量。缺陷是仍然需要將PCR產(chǎn)物打開后放入儀器，仍然存在很大的污染風(fēng)險。
二、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR ，qPCR）技術(shù)
熒光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。熒光定量PCR的發(fā)展史是一部ABI、羅氏和伯樂等巨頭的蕩氣回腸的斗爭史，感興趣的可以去查查。該技術(shù)是目前最成熟，使用最廣泛的半定量PCR技術(shù)。
熒光染料法（SYBR Green I）：
SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)的雙鏈DNA量呈比列，且會隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。由于染料是與雙鏈DNA的非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。
熒光探針法（Taqman 技術(shù)）：
PCR擴(kuò)增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴(kuò)增時（在延伸階段），Taq 酶的 5' —— 3' 切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步。臨床檢測中Taqman探針法是最常用的檢測方法。
qPCR的優(yōu)點
方法成熟，配套儀器試劑齊全
試劑成本中等
操作簡單
檢測敏感性高，特異性高
qPCR的缺點
1.目的基因發(fā)生突變導(dǎo)致漏檢
2.低濃度模板檢測結(jié)果無法確定
3.使用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測時誤差較大。
三、數(shù)字PCR（digital PCR ，dPCR）技術(shù)
數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR能夠直接讀出DNA/RNA分子的個數(shù)，是對起始樣品核酸分子的絕對定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。
2006年，F(xiàn)luidigm公司第一個生產(chǎn)商業(yè)化的基于芯片的dPCR儀。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系統(tǒng)，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系統(tǒng)，采用高密度的納升級微流控芯片技術(shù)，將樣本均勻的分配至20 000個單獨(dú)的反應(yīng)孔中。
2011年，Bio-Rad公司推出了基于微滴的QX100 dPCR儀，利用油包水技術(shù)，將樣品平均分配到20 000個微滴油包水中，利用微滴分析儀對微滴進(jìn)行分析。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR儀，在高壓氣體驅(qū)動下，將每個標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬至1 000萬個皮升級別微滴的反應(yīng)乳液。
至此數(shù)字PCR就形成了2大派別，芯片式和微滴式。不論是哪種數(shù)字PCR，其核心原理都是有限稀釋，終點PCR和泊松分布。將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，平均分配成幾萬個PCR反應(yīng)，分配到芯片或微滴中，使每個反應(yīng)中盡可能含有一個模板分子，進(jìn)行單分子模板PCR反應(yīng)，通過讀取熒光信號的有或無進(jìn)行計數(shù)，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)泊松分布的校準(zhǔn)進(jìn)行絕對定量。
dPCR的優(yōu)點
實現(xiàn)絕對定量
更高的敏感性和特異性
可以檢測低拷貝樣品
dPCR的缺點
1.儀器設(shè)備和試劑昂貴
2.操作復(fù)雜，檢測時間長
3.檢測范圍較窄
目前三代的PCR技術(shù)各有各的優(yōu)缺點，也各有各的應(yīng)用領(lǐng)域，并不是一代取代一代的關(guān)系。技術(shù)的不斷進(jìn)步給PCR技術(shù)注入了新的活力，使其能解鎖一個又一個的應(yīng)用方向，使核酸檢測更方便、更準(zhǔn)確。
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