實驗做到崩潰?這 10 個技巧讓做出發表級 WB 圖
01
快速處理您的組織
使用干凈的工具收獲和處理組織樣本。要去除可能影響蛋白質穩定性的污染物，請在冰冷的中性 pH 緩沖液中短暫洗滌。洗滌后，在液氮中快速冷凍組織，以保留蛋白質結構和特征，例如翻譯后修飾（PTM）。組織樣本可以保存在冰上，以便立即勻漿；然而，由于蛋白質降解仍可能在 –20 °C 下發生，因此組織樣品應保存在 –80 °C 以長期儲存。
02
仔細選擇裂解緩沖液
在選擇最佳裂解緩沖液以有效地從組織中提取蛋白質時，請考慮 pH、離子強度以及去垢劑和變性劑類型等參數。RIPA 緩沖液是使用最廣泛的裂解緩沖液。在緩沖液選擇過程中，還應考慮靶蛋白的細胞定位；例如，對于細胞質蛋白，推薦使用 Tris-HCl 裂解緩沖液，而 RIPA 是提取核蛋白的首選。為了富集膜、胞質或細胞核部分中的低豐度蛋白質，可能需要組織分級分離。裂解緩沖液的量基于組織的大小/重量；考慮緩沖液與組織的比例對于確保有效裂解非常重要。首次建立從組織中提取蛋白質的方案時，請嘗試使用不同的裂解緩沖液，以優化組織類型和特定蛋白質的條件。
03
選擇最佳破碎組織方法
由于與細胞相比，樣品結構程度更高，因此組織需要更嚴格的破碎方法，如均質化技術。為了進一步解離組織并剪切細胞 DNA，可能需要對樣品進行超聲處理。在此步驟中避免起泡很重要，因為它可能會降低您的回收量。確保已優化機械破碎機的電源設置并使用預冷設備。
由于脂質會影響蛋白質免疫印跡的質量，因此請確保去除樣品中的脂肪。從植物組織中提取蛋白質特別具有挑戰性，因為它們富含蛋白酶并且含有高水平的代謝物，可以干擾蛋白質提取（Wang 等人，2008）。提取過程必須針對您使用的特定植物組織進行優化。已經為植物組織開發了幾種蛋白質提取方案，例如三氯乙酸/丙酮沉淀法或基于苯酚的提取（Wang 等人，2008）。
04
在樣品制備過程中抑制蛋白質降解并保留翻譯后修飾
細胞膜的破壞釋放出可以降解蛋白質的酶，盡管通過將樣品保持在低溫下來最小化其活性（Scopes 1994）。為了限制蛋白酶活性，可以在緩沖液中加入強變性劑，如尿素。然而，這些條件可能會影響某些蛋白質的完整性；因此，裂解緩沖液常規補充蛋白酶抑制劑混合物。常見的蛋白酶抑制劑包括（PMSF），aprotinin，leupeptin，and pepstatin。
SUMO 化蛋白的鑒定可能特別具有挑戰性。這是由于去除 SUMO 偶聯物的異肽酶的活性，并且通常只有一小部分蛋白質被 SUMO 化。因此，為了保存 SUMO 化，建議在裂解緩沖液中添加 isopeptidase inhibitors（Xiao 等人，2015）。泛素偶聯物的去除也很容易通過蛋白質泛素水解酶（稱為去泛素酶（DUB））發生。因此，必須在細胞裂解緩沖液中添加 EDTA 或 EGTA 以及碘乙酰胺（IAA）或 N-乙基馬來酰亞胺（NEM）。IAA 和 NEM 通常以 5～10 mM 的濃度使用。然而，高達十倍的高濃度對于維持某些蛋白質的泛素化至關重要，例如 IRAK1（Emmerich 和 Cohen 2015）。用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理也保留泛素化并阻止 26S 蛋白酶體的蛋白質降解（Kisselev 等人，2012）。
05
在凝膠上樣前定量樣品
測定樣品濃度可確保凝膠的上樣量相等，并使您能夠比較處理樣品與未處理樣品中或實驗時間過程中蛋白質水平的差異。Bradford assays，如 Bio-Rad 的 Quick Start Bradford Protein Assay，可用于每孔總蛋白質上樣量的標準化。
06
尋找最好的凝膠
確定最適合目標蛋白的凝膠的一個很好的起點: 根據蛋白質的分子量選擇聚丙烯酰胺百分比。例如，對于高分子量，選擇低百分比，對于低分子量，選擇高百分比。如果要檢測單個蛋白質，請選擇非梯度凝膠。當需要可視化一系列蛋白質大小時，選擇梯度凝膠。非常高的電壓設置可能會導致凝膠「微笑」；為避免這種影響，請在冷藏室中電泳凝膠并使用預冷的電泳緩沖液。
07
驗證蛋白質上樣量
根據蛋白質的細胞定位選擇最佳上樣對照。細胞質蛋白的常用上樣對照包括管家蛋白，例如 beta-actin 或 beta-tubulin；對于核蛋白，通常使用 histone H1 或 histone H3。近年來，許多研究報告了一些最常用的管家蛋白不適合當做可靠的蛋白質歸一化，強調生理和病理因素會影響它們的表達水平（Ferguson 等人，2005）。為了使加載歸一化有意義，必須在不同的實驗條件下保持恒定的水平；例如，加載控件的表達不應受到處理的影響。即使在單個組織樣本中，beta-actin 表達也被證明不是均勻的（Eaton 等人，2013）。此功能突出了使用管家蛋白進行比較蛋白質水平分析的問題。
管家蛋白的另一個常見問題是過載，這會導致檢測超出動態范圍。樣品的動態范圍取決于組織和蛋白質測定方法。
Bio-Rad 的免染成像技術是 Bio-Rad 的免染成像技術，是用染料（如 Ponceau S）觀察蛋白質和蛋白質裝載可視化的一個很好的替代方案。該技術能夠將每個泳道中的條帶標準化為總蛋白質（圖 1，Taylor 等人，2013）。該方法快速，并使用摻入凝膠中的轉利染料使蛋白質在 UV 激發時發出熒光。與 Ponceau S 染色相比，免染技術提供了更大的線性范圍并減少了可變性（Rivero-Gutierrez 等人，2014 年）。此外，由于不需要對印跡進行染色，因此非常方便。
圖 1. 通過免染技術為總蛋白質測量提供線性動態范圍。A，HeLa 細胞裂解物稀釋 80～2.5 μg 總蛋白。B，HeLa 細胞裂解物從 20～1 μg 總蛋白稀釋。
08
考慮膜類型
蛋白質可以轉移到硝酸纖維素或 PVDF 膜上。PVDF 膜具有很高的機械強度，最適合需要膜剝離和重新剝離的情況。PVDF 具有疏水性，需要預浸泡在甲醇中。硝酸纖維素膜具有高信噪比，不需要甲醇預處理。需要注意的是，硝酸纖維素膜不能與含有 SDS 的轉印緩沖液一起使用。在選擇膜類型時，您可能還需要考慮其他參數，例如孔徑，這些參數會影響較大蛋白質與較小蛋白質的結合效率。
09
降低內源性免疫球
蛋白的高背景
在對組織裂解物進行蛋白質印跡檢測時，來自內源性 IgG 和非特異性二抗結合的信號可能會掩蓋對低豐度蛋白質或特定分子量蛋白質的檢測。對于 ~50 kD 和 ~25 kD 的蛋白質尤其如此，它們可能會被組織樣品制備的變性和還原步驟中產生的 IgG 重鏈和輕鏈所掩蓋。
然后，IgG 鏈由與 IgG 重鏈和輕鏈結合的常規二抗常規檢測。當使用組織樣本（例如胸腺或甲狀腺）時，這個問題最為明顯，這些樣本是免疫系統的一部分，因此含有大量的內源性免疫球蛋白（圖 2）。
TidyBlot 蛋白質印跡檢測試劑（STAR209P 和 STAR209PA）僅與用于蛋白質印跡檢測的天然抗體結合，因此為生成干凈的組織裂解物印跡提供了良好的解決方案。
圖 2. 使用 Immun-Star 山羊抗小鼠（GAM）-HRP 抗體對不同的組織裂解物進行背景染色。
10
包括合適的組織對照
為了確保一抗的特異性，使用陽性和陰性組織對照非常重要。對于陽性對照，請使用文獻中指出表達高水平目標蛋白的組織類型、過表達目標蛋白標記的小鼠組織或重組蛋白。推薦的陰性對照包括僅二抗對照（省略一抗孵育步驟）和已知不表達靶蛋白的組織樣品。包括特定的敲除樣本或組織特異性敲除小鼠模型，通過顯示未在某種組織類型中檢測到靶標來確認抗體的特異性可能會有所幫助。
您還需要意識到，在疾病狀態下存在特定蛋白質表達的定量差異;科學文獻中常見的一種現象。為了解釋這些差異，您可以包括來自健康和疾病組織的樣本來分析異常表達。
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